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钙和体内骨稳态息息相关。骨细胞内的Ca2+是一种重要的第二信使。胞内Ca2+水平的细微变化可影响正常的骨稳态,胞内钙离子浓度的改变会导致钙离子参与细胞凋亡。TRPV6是TRP家族中的一员,对钙离子有高度选择性,由细胞内低钙水平激活;是钙离子跨细胞转运的限速门控通道。本文旨在通过过表达TRPV6慢病毒感染成熟小鼠破骨细胞进而研究TRPV6过表达对破骨细胞钙转运相关基因及细胞凋亡相关基因表达的影响,为探究破骨细胞钙离子转运及凋亡提供理论依据。采用PCR扩增方法获得TRPV6全基因片段,随后将TRPV6全基因片段交换入已酶切的慢病毒载体构建重组质粒。将重组质粒转化入感受态细胞进行菌落PCR鉴定。将鉴定出的阳性克隆转化子培养测序。将测序结果与TRPV6基因序列一致的菌液继续培养并抽提质粒。随后将GV365质粒、pHelper1.0和pHelper 2.0载体质粒及转染试剂与293T细胞共培养并进行质粒表达检测。最后进行慢病毒浓缩与纯化以用于后续试验研究。取5～6周龄小鼠,拉颈处死,置于75%酒精中浸泡3～5 min消毒。取下股骨和胫骨放入含双抗的4℃的PBS中,随后转移至超净台。用2mL注射器双向冲洗骨髓腔多次,采用Ficoll分离单核细胞。用含100 ng/mL M-CSF的完全细胞培养液重悬,细胞计数,调整细胞密度为2×105/mL,向96孔板中以0.2 mL/孔加入上述细胞悬液。放入5%CO2恒温培养箱中,37℃培养3d,期间观察细胞生长情况,每两天更换完全细胞培养液。用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色以鉴定破骨细胞。选取生长状态良好的破骨细胞,分为空白细胞组、阴性对照组(慢病毒转染)和过表达TRPV6慢病毒转染试验组。单核细胞在RANKL和M-CSF刺激下分化为成熟破骨细胞,于第五天进行转染试验,转染后第三天于荧光倒置显微镜下观察慢病毒转染效果。结果显示破骨细胞荧光表达丰度较高,感染效率95%左右且细胞生长良好,可用于后续试验。随后通过荧光定量PCR和Western-blot分别于mRNA水平和蛋白水平测定TRPV6过表达时破骨细胞钙转运相关基因与细胞凋亡相关基因表达水平变化。利用Annexin V-APC/PI双染色于流式细胞仪测定TRPV6过表达对细胞凋亡率的影响。荧光定量PCR结果显示,与空白对照组相比,过表达慢病毒LV-TRPV6组TRPV6、CaBP-D28k、NCX1 基因 mRNA 表达水平显著增加(P<0.05),PMCA-1B mRNA表达水平无明显差异;阴性对照组钙转运相关基因mRNA表达水平无明显差异。线粒体凋亡途径相关基因Bax、Apaf-1、C9基因mRNA表达水平极显著降低(P<0.01),Bcl-2基因mRNA表达水平无明显变化;阴性对照组线粒体凋亡途径相关基因mRNA表达水平无明显差异。死亡受体凋亡途径相关基因FasL、Fas基因mRNA表达水平显著增加(P<0.05),C8、C3基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05)Western-blot结果显示,与空白对照组相比,过表达慢病毒LV-TRPV6组TRPV6、CaBP-D28k及NCX1基因蛋白表达水平显著增加(P<0.05);阴性对照组钙转运相关基因蛋白表达水平无明显差异。与空白对照组相比,过表达慢病毒LV-TRPV6组Bax、C8、C3基因蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);阴性对照组细胞凋亡相关基因蛋白表达水平无明显差异。流式细胞仪结果显示,与空白对照组相比,Annexin V-APC/PI双染色后,TRPV6过表达导致破骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05);阴性对照组无明显差异。结论:本试验成功构建过表达TRPV6慢病毒载体,且对小鼠破骨细胞转染效果良好。破骨细胞过表达TRPV6基因导致钙转运相关基因表达增加并抑制破骨细胞凋亡。