背景自组装纳米结构可以介导酶分子数量的增加和抗体的有效固定,用于酶联免疫吸附试验中提高检测灵敏度。分子自组装是指分子在没有人为干预的情况下,自发形成结构高度有序的分子组装体的过程,其广泛存在于自然界中,是生命体最主要的组织形式。近年来,分子自组装这一策略被纳米技术科学家所借鉴,已成为纳米材料制备的重要策略。但是,分子自组装是一个自发的热力学过程,其发生过程难以控制;与此同时,自组装元件的结构相对单一,不同的自组装元件间难以发生相互作用,这导致自组装的尺寸控制与多功能化困难,限制了检测灵敏度的提高。因此,开发可控的、多功能化的自组装策略是纳米器件设计和制备所面临的关键技术挑战。目的探索自组装操控技术,发展自组装纳米结构的多功能化策略,建立自组装多功能化纳米器件的可控制备方法,制备具有信号扩增能力的蛋白纳米器件。方法本研究以重组的人重链铁蛋白(recombinant heavy chain of human ferritin,rHF)笼型纳米结构为材料,利用蛋白质工程技术和胞内蛋白质修饰系统,从体外与胞内两个途径对蛋白纳米材料的可控自组装进行探索,并开展可控多功能化和非对称功能化的研究。首先,我们在体外建立了一种尺寸可调的可控自组装策略,该策略通过控制自组装元件表面的相互作用位点数量,进而控制发生相互作用的自组装元件数量,最终实现自组装纳米结构的尺寸可控。基于此原理,我们利用自生物素化铁蛋白(autobiotinylated ferritin nanoparticles,bFNP)和辣根过氧化物酶修饰的链霉亲和素(streptavidin-labeled horseradish peroxidase,SA-HRP)作为组装元件,以生物素-亲和素这一特异性相互作用为驱动力,构建了尺寸可调的酶纳米复合物(enzyme nanocomposite,ENC)。所获得的酶纳米复合物具有亲和素的表面,同时整合大量的酶分子,可用于免疫检测中,大幅提高了常规免疫检测的灵敏度。其次,我们初步探索了铁蛋白纳米颗粒的胞内可控非对称自组装的策略,通过学习和借鉴合成生物学的研究方法,利用细菌的代谢调控网络,建立细菌内蛋白差量表达体系,使具有不同功能配体的铁蛋白自组装元件在大肠杆菌胞内差量表达和非对称自组装,最终实现表面具有不同功能配体数量的非对称纳米颗粒的胞内一步可控制备。结果在尺寸可调酶纳米复合物的研究中,可控的自组装可以通过调节两个构建元件的化学计量比来实现。组装过程中,化学计量比的可控通过运用不同量的SA-HRP滴定等量的bFNPs而实现。通过对不同比例构建的酶纳米复合物进行表征,我们发现在饱和或过量的SA-HRP滴定中,形成核心只含有一个铁蛋白颗粒的单体酶纳米复合物;当逐渐降低SA-HRP的滴定量,bFNPs将彼此共享SA-HRP,导致bFNPs的聚集和同时ENC尺寸的增加。在胞内可控自组装中,成功构建了共表达载体,验证了不同功能化的蛋白亚基在胞内自组装时可以同时组装在一个蛋白笼上,得到了非对称多功能化的铁蛋白纳米颗粒。结论(1)我们可以通过控制自组装元件表面的相互作用位点数量,进而控制发生相互作用的自组装元件数量,最终实现自组装纳米结构的尺寸调控,构建了用于高灵敏免疫分析中的尺寸可调的酶纳米复合物。(2)通过在细菌内差量表达具有不同功能配体的铁蛋白自组装亚基,获得并初步验证了不同功能化的蛋白亚基的混合组装,实现多功能化的非对称纳米颗粒的胞内一步可控制备。