【摘 要】
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背景与目的:CD8+T细胞是针对感染和癌症的保护性免疫的重要参与者。临床上针对感染和癌症免疫治疗的效果主要依赖于免疫记忆的形成与维持。在抗原刺激清除后,95%以上效应性T细胞（Effector T cell,Teff）进入凋亡,仅有极少部分分化为记忆性T细胞（Memory T cell,Tm）。研究指出代谢模式的转变在维持Tm稳态方面至关重要,然而将代谢信号与记忆性T细胞的形成与稳态相联系起来的调
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背景与目的:CD8+T细胞是针对感染和癌症的保护性免疫的重要参与者。临床上针对感染和癌症免疫治疗的效果主要依赖于免疫记忆的形成与维持。在抗原刺激清除后,95%以上效应性T细胞（Effector T cell,Teff）进入凋亡,仅有极少部分分化为记忆性T细胞（Memory T cell,Tm）。研究指出代谢模式的转变在维持Tm稳态方面至关重要,然而将代谢信号与记忆性T细胞的形成与稳态相联系起来的调控机制仍不清楚。芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）是一种配体激活的转录因子,在与配体结合后调节下游基因的表达。目前,越来越多的研究关注AhR在肿瘤免疫中的调节作用。结合研究背景与课题组前期研究成果,我们发现AhR多与代谢模式相对处于静息状态的细胞类型存在较强的相关性;而CD8+Tm作为代谢活动相对静息的细胞类型,脂肪酸代谢和糖原合成体系在其中占据主要地位,糖酵解代谢则相对处于受抑制状态。基于以上基础,我们将在本项研究中着重探讨AhR在CD8+Tm记忆性稳态形成与代谢模式调控中的作用。方法:通过对已发表单细胞测序数据再分析获得相关基因表达情况;在体外及在体模型中获取不同类型CD8+T细胞,分别运用实时荧光定量PCR技术、免疫印迹技术和免疫荧光技术检测基因的表达水平及核转位情况;运用流式细胞术检测AhR小分子抑制剂及激动剂对Tm形成的影响;运用Seahorse细胞能量代谢仪检测AhR对Tm糖酵解能力的影响;运用shRNA敲低AhR表达后检测体内外模型中CD8+Tm的形成情况;运用CRISPR-Cas9技术构建全基因组敲除小鼠,检测CD8+Tm形成情况以及代谢模式的改变;抑制AhR后通过实时荧光定量PCR技术检测糖酵解代谢关键酶己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）与白介素21（Interleukin,IL21）的表达改变情况。结果:（1）单细胞测序及体外诱导培养数据均提示AhR表达水平随CD8+T细胞的发育天数而升高;（2）与Teff相比,Tm中AhR在m RNA及蛋白的表达水平更高;（3）具有向记忆性分化倾向的CD8+T细胞有更高的Ahr表达;（4）CD8+Tm内AhR核转位水平与CD8+Teff相比更强,下游靶基因表达随之上调;（5）AhR对CD8+Teff的形成没有显著影响,而对CD8+Tm的形成有促进作用,抑制AhR导致CD8+Tm形成数量减少;（6）体外实验、shRNA敲减AhR表达在体过继模型与Ahr-/-基因缺陷鼠模型中CD8+Tm形成受到抑制,同时与记忆性形成相关的基因Bcl6、Lef1、Tcf7表达减低;（7）AhR通过抑制CD8+Tm糖酵解能力影响代谢模式转变;（8）单细胞测序数据提示糖酵解关键酶HK2可能受到AhR负向调控;（9）体内外实验均显示抑制AhR可上调CD8+Tm中HK2的表达。（10）体内外抑制AhR表达后,Il21 m RNA的表达上调。结论:结合体外诱导培养及体内过继模型的实验结果,我们认为在CD8+T细胞中,AhR显著影响CD8+Tm的形成过程。AhR可以通过抑制HK2表达,降低CD8+Tm细胞糖酵解能力。AhR可以调控记忆形成相关基因表达,促进IL21合成,共同促进CD8+Tm分化。综上,AhR可通过调控CD8+T细胞代谢模式的转变,同时调控与记忆性形成相关的细胞因子的表达,共同促进记忆性稳态的形成。
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