论文部分内容阅读
目的:研究CAV2基因在胰腺癌细胞中的表达程度,及其对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。挖掘在该影响中与CAV2基因有关的信号通路。并进一步探究其与内吞作用及上皮-间充质化的关系,以发掘CAV2基因影响胰腺癌细胞进展的深部作用机制。为基础医学及临床医学上对胰腺癌的研究和治疗寻找有效靶向目标和相关药物提供理论基础。方法:通过THE CANCER GENOME ATLAS（TCGA）和GENE EXPRESSION OMNIBUS（GEO）数据库进行生物信息学分析,以初步确定CAV2在胰腺癌中的促癌作用及其潜在靶点Wnt7A。在多株胰腺癌细胞系中对CAV2的表达情况进行q RT-PCR研究,挑选出表达量最高的两株细胞进行后续实验,即为:PAC-1及BXPC-3。并利用Western Blot实验,验证在普通胰腺细胞HPC-Y5和在上述两株胰腺癌细胞中CAV2基因的蛋白表达量差异。在胰腺癌细胞系中通过慢病毒载体稳定转染以过表达CAV2基因。转染成功后,将实验组分为三组:未经任何处理的原始胰腺癌细胞组、过表达CAV2基因胰腺癌细胞组以及转染空载体慢病毒胰腺癌细胞对照组。通过划痕愈合实验、CCK-8实验、Trans-Well实验以及平板克隆实验来验证CAV2对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。应用q RT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术验证目标细胞系中Wnt7A和β-Catenin的表达情况,验证了CAV2是Wnt7A/β-Catenin的正向调节因子。通过生物信息学分析、CCK-8实验、q RT-PCR、以及免疫荧光素酶检测显示,MiR-4723是Wnt7A/β-Catenin的负向调节因子。为进一步研究CAV2对MiR-4723/Wnt7A影响的作用机制,通过q RT-PCR检测了通过慢病毒过表达MiR-4723后的胰腺癌细胞中,CAV2的基因表达。随后通过免疫荧光技术、Western Blot和q RT-PCR分析了一系列与内吞作用和上皮-间质转化（EMT）有关的几个基因表达情况。结果:1.通过TCGA和GEO数据库分析发现,CAV2基因在正常胰腺组织中表达量较低,在胰腺癌组织中表达量较高。且在胰腺癌患者中,CAV2的表达量随着年龄的增大而增加,并且其预后也随其表达量的增加而降低。在TNM分期中,也表现出CAV2的表达量在T3和T4期表达量较T1和2期高。通过q RT-PCR实验得知在胰腺癌多株细胞中,PANC-1和BXPC-3中CAV2的表达量是最高的,且在Western Blot实验中显示,CAV2的表达量在胰腺癌细胞系中明显高于普通胰腺细胞HPC-Y5。2.在划痕愈合实验、CCK-8实验、Trans-Well实验以及平板克隆实验中得到验证,过表达CAV2的胰腺癌细胞增殖、侵袭迁移和克隆等能力与对照组相比显著升高。3.TCGA数据库筛选了182个胰腺癌相关的肿瘤和几个相关基因的表达趋势。这些分析得出的结果显示,CAV2和Wnt7A在胰腺癌组织及其癌旁组织中的表达的相关性趋势明显较其它基因组合高。为验证其相关性,再次通过q RT-PCR得到结果,在过度表达CAV2的胰腺癌细胞中,Wnt7A和β-catenin的基因表达明显增加。Western Blot实验结果显示,Wnt7A和β-catenin的蛋白表达在过表达CAV2的胰腺癌细胞中明显增加,其灰度值也有统计学意义。在免疫荧光技术中的检测也得到结果,与两个对照组相比,CAV2过表达的胰腺癌细胞中β-catenin的核内表达水平明显升高。4.根据GEO数据库的分析,MiR-4723在胰腺癌肿瘤组织中明显下调,且与相应的低表达组相比,MiR-4723高表达组的胰腺癌患者生存率更高。通过慢病毒在胰腺癌细胞中过表达MiR-4723后利用CCK-8技术检测了其增殖能力,我们发现与对照组相比,MiR-4723上调后其增殖能力下降。为了进一步验证MiR-4723和Wnt7A/β-catenin之间的关系,进行了q RT-PCR检测,结论是MiR-4723上调后,胰腺癌细胞中Wnt7A的表达下调。且免疫荧光素酶检测显示,在两种胰腺癌细胞系中过表达MiR-4723后,野生型Wnt7A的荧光素酶活性明显降低。5.应用q RT-PCR得出结论,与对照组细胞相比,过表达MiR-4723的胰腺癌细胞系中CAV2的基因表达明显下调。6.为探求CAV2影响MiR-4723/Wnt7A通路的机制,利用生物信息学分析和免疫荧光检测技术得到结果,相对于对照组,过表达CAV2的胰腺癌细胞核内EGFR表达水平明显上调且CAV2和EGFR的表达趋势在胰腺癌及其副肿瘤组织中的相关性明显较高,两者的表达关系显示为正相关。应用q RT-PCR和Western Blot实验检测一系列与内吞作用及EMT有关的基因得出结果,PDGFR和EGFR的蛋白和基因表达在过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中明显降低,而在过表达CAV2或Wnt7A的细胞中则明显升高。Wnt7A蛋白和基因的表达在过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中减少,在过表达CAV2的细胞中增加。此外,CAV2蛋白在过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中表达减少,而在过表达Wnt7A的细胞中表达增加。过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中PAR3蛋白和基因的表达明显增加,而过量表达CAV2或Wnt7A的细胞中PAR3蛋白和基因的表达减少;过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中Claudin-6蛋白和基因表达增加,而过表达CAV2或Wnt7A的细胞中Claudin-6表达减少。E-cadherin蛋白和基因表达在过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中明显增加,而在过表达CAV2或Wnt7A的细胞中则减少;Vimentin和Snail蛋白和基因表达在过表达MiR-4723的胰腺癌细胞中减少,而在过表达CAV2或Wnt7A的胰腺癌细胞中增加。结论:1.CAV2在胰腺癌细胞及胰腺癌组织中高表达,且与患者的生存预后密切相关。2.CAV2在胰腺癌中具有明显促癌作用,上调CAV2可以促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。3.Wnt7A是CAV2的潜在靶点,并且CAV2是Wnt7A/β-Catenin信号通路的正向调节因子。4.MiR-4723是Wnt7A/β-catenin信号通路的负向调节因子。5.CAV2与MiR-4723在Wnt7A/β-Catenin信号通路中互为遏制因素。6.CAV2可以通过抑制细胞内吞作用及促进EMT作用调控MiR-4723/Wnt7A信号通路,从而发挥其在胰腺癌细胞中促进增殖、侵袭和迁移的作用。