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目的:1.建立大鼠后囊膜浑浊模型并测定Pax6转录本的表达变化。2.在HLE-B3细胞系通过敲减及回复表达Pax6转录本,观察其对B3细胞的影响。3.利用基因芯片技术进行全基因表达谱检测观察随着Pax6转录本表达变化对下游基因的影响。方法:1.32只大鼠随机分组右眼行ECLE,分别取手术后不同时间点的大鼠后囊膜组织,通过Real-time PCR测定后囊膜上Pax6基因转录本的表达水平。2.利用半定量PCR测定了人HLEB3细胞中Pax6的水平,构建靶向Pax6的shRNA慢病毒载体,应用shRNA干扰慢病毒感染B3细胞,观察Pax6基因敲减后对B3细胞活力增殖的影响。3.构建分别表达Pax6基因两个转录本的慢病毒载体,在Pax6敲减后的细胞中进行回复表达,研究两个转录本对B3细胞活力增殖的影响。4.利用上述shRNA干扰后及分别回复转录本1或转录本2,分别抽提RNA,再用Agilent 4X44K人类全基因表达谱芯片进行检测,分析Pax6基因变化对下游基因的影响及2个转录本的功能差异。结果:1.成功复制了大鼠后发障模型,构建了大鼠Pax6基因的质粒并进行测序,获得大鼠Pax6两个转录本的序列。检测Pax6两个转录本的表达,在手术后7天,Pax6两种转录本的表达均有所增加,在术后14天时又有一定程度的回复,至28天时降至最低。两种转录本的表达趋势比较相似。2.成功构建了 Pax6 shRNA重组慢病毒载体,抑制Pax6基因表达后,B3细胞凋亡的数目成倍增加。3.敲减Pax6基因的表达水平后,单独回复表达其中一个Pax6转录本,不但不能逆转敲减Pax6造成的细胞活力下降、增殖减缓,反而加重了这种变化。特别是回复表达转录本2,导致了更明显的细胞活力下降和增殖减缓,并且凋亡细胞数量也显著的增加。4.基因芯片的结果显示Pax6基因被敲减后,有224个基因表达被上调,144个基因表达被下调;RNAi的同时回复转录本1的表达,引起758个基因表达上调和211个基因表达下调;RNAi的同时回复转录本2的表达,引起2033个基因表达上调和617个基因表达下调。回复表达所引起的基因表达的变化要更加明显,尤其是2号转录本。结论:1.大鼠后发障模型Pax6基因的表达存在变化,而且在术后即刻、7d、14d、28d表达量有规律性改变,两种转录本的表达趋势比较一致。2.Pax6基因表达下调、在Pax6基因下调后单独上调转录本1或转录本2的表达,都表现出一致的抑制细胞增殖,凋亡增加,但程度上是有差异的。3.基因芯片结果显示:Pax6两个转录本的回复表达,比Pax6的基因敲减,引起了更多与细胞周期和凋亡相关的基因表达的变化,包括WNT、p53信号通路的一些基因和Caspase相关的基因。