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奶牛在围产期时,常常会发生能量负平衡,为了消除或缓解围产期奶牛能量的负平衡,本研究从瘤胃内的优势菌——反刍兽月形单胞菌入手,对该菌发酵代谢通路进行调控,以期望从切断乙酸的生成来增加生糖先质—丙酸的产量和比例。本研究首先利用CODEHOP设计了反刍兽月形单胞菌乙酸生成途径的关键酶——乙酸激酶(AK)的简并引物,并且从该菌基因组中成功克隆出749 bp的乙酸激酶片段。以克隆的乙酸激酶片段为基础,将其连入pUC18载体中构建了针对乙酸激酶的质粒pUC18-ack,在这个质粒的基础上,将一段从干酪乳杆菌中克隆的耐酸基因ffh插入到质粒载体pUC18-ack的ack基因内部,构建了自杀性质粒载体pUC18-ack::ffh。利用该载体,通过同源重组技术对K6基因组的ack基因进行定点插入失活,切断了K6乙酸生成的途径,利用氟乙酸平板成功筛选出三株ack基因缺失的反刍兽月形单胞菌重组子,乙酸激酶活性分析结果显示这三株菌均为ack基因缺陷型,表明成功构建了反刍兽月形单胞菌乙酸生成缺陷株K6Δ(ack)。最后对基因工程菌K6Δ(ack)进行了体外发酵实验,同时与原始菌K6进行了比较,结果表明,K6Δ(ack)仅保留微弱的产乙酸能力,同时丁酸的产量显著提高了,丙酸的产量并没有显著高于原始菌,但是显著提高了丙酸/乙酸比例,K6Δ(ack)的发酵类型倾向于丙酸型。