研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染的主要标志是血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)持续阳性。HBsAg相对于HBV复制来讲呈过度表达。HBsAg转阴及发生血清学转换(抗-HBs阳性)意味着抗HBV治疗取得理想应答。目前抗病毒治疗的HBsAg血清学转换率很低:聚乙二醇干扰素为3%-8%,一年的核苷(酸)类药物治疗<2%,虽然拉米夫定、阿德福韦及干扰素-alpha均可降低血清HBsAg水平。因此需要明确的问题是抗病毒治疗时血清HBsAg的变化特征,以及影响血清HBsAg水平的因素。课题整体设计本课题由系列互相关联且相对独立的六个部分组成,根据具体完成的时间顺序可以分为:1、观察抗病毒治疗(阿德福韦或聚乙二醇干扰素-alpha)时血清HBsAg的总体变化特征;2、了解阿德福韦或聚乙二醇干扰素-alpha治疗且血清HBV DNA负荷持续降低时个体患者血清HBsAg的变化特点;3、影响拉米夫定治疗早期(12周)血清HBsAg变化的因素分析;4、拉米夫定长期治疗取得持续病毒学应答时血清HBsAg水平的变化规律;5、未接受抗病毒治疗患者血清HBsAg水平的影响因素;6、体外试验了解HBV基因型对HBsAg表达的影响。材料和方法研究对象:本研究的第一和第二部分的研究对象为本中心参加阿德福韦(10mg/日,口服,1/日)或聚乙二醇干扰素-alpha(180微克/次,1/周,皮下注射)注册临床试验的患者。所有患者均要求为HBsAg阳性超过6个月、HBeAg阳性、之前至少3个月未接受过抗病毒治疗、治疗前HBV DNA水平不低于5.010g10拷贝/ml。检查和随访时间至少包括基线、治疗12周、治疗28周(阿德福韦)或24周(聚乙二醇干扰素-alpha)以及治疗48周。其中第二部分的患者要求为血清HBV DNA持续下降,定义为:接受抗病毒治疗(阿德福韦或聚乙二醇干扰素-alpha)的患者,血清HBV DNA的水平分别为:治疗48周<治疗24(阿德福韦)周或28周(聚乙二醇干扰素-alpha)<治疗12周<基线。本研究第三部分的研究对象为在南方医院门诊或病房接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者。所有患者均为第一次接受抗HBV治疗,治疗前为HBeAg阳性。治疗方案为拉米夫定100毫克/日,口服。患者每次随访时检查谷丙转氨酶(正常值上限为40 U/L)以及HBV DNA定量(检测下限为1000拷贝/毫升)。分别在治疗基线和治疗第12周收集血清。本研究第四部分的研究对象从第三部分研究对象中选取,附加条件为:1)、拉米夫定治疗至24周时血清HBV DNA降至检测不到(罗氏公司Lightcycler方法,深圳匹基试剂,检测下限为1000拷贝/毫升)并持续至观察期末(3年);2、)定期随访(间隔3至6个月),每次随访检测血清谷丙转氨酶、血清HBsAg及HBeAg(亚培AxSYM方法)以及HBV DNA定量。本研究第5部分的研究对象为2003年7月至2006年12月间,在南方医院感染内科门诊或病房诊治且符合以下标准的患者:HBsAg阳性超过半年,ALT反复或持续异常,HBeAg阳性或阴性,HBV DNA定量超过10~4拷贝/ml;之前未接受过任何形式的抗HBV治疗;已经确定了HBV基因型(B或C),排除HCV或HDV感染;无严重酗酒史。HBsAg定量:HBsAg定量检测仪为Abbott Architect i2000(雅培),试剂为Abbott Architect(R) HBsAg(雅培)。该方法是以化学发光微粒子免疫技术(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)为基础来对HBsAg进行测定。按照试剂盒和仪器操作程序进行。第一次检测值高于检测上限(250IU/ml)的样本需要手工稀释,比例1:500。检测下限为0.05 IU/ml。HBV基因型检测:采用聚合酶链反应联合限制性片段长度多态性分析的方法(PCR-RFLP),可以检测HBV基因A、B、C和D型。或者采取直接测序的方法,基因型判断采用与已知HBV序列相比较的方法,核苷酸序列差异<8%认定为同一基因型。质粒和细胞:HBV复制质粒为构建于puc-19质粒上的1.24倍HBV基因组的HBV DNA片段,包括我国常见的HBV基因型Ba和C。置换质粒的构建是分别以HBV/B和C型复制质粒为主体,将与HBsAg基因转录可能有关的区域进行置换。置换区域包括覆盖HBV大外膜蛋白基因的区域(nt2818-nt 1604,置换1型)、主体为HBV主外膜蛋白基因的区域(ntl79-nt1604,置换2型)和主体为HBV外膜主蛋白基因的启动子区域(surface promoter 2,SP2;nt2812-nt179,置换3型)。细胞株为肝癌细胞系Huh7细胞,本实验室保存。Huh7细胞按5×10~5接种于6孔板中,培养液为含10%胎牛血清的DMEM液。转染后72小时收集上清和细胞。统计学分析:对同一患者的系列标本HBsAg或HBV DNA水平变化的比较采用重复测量(广义线性模型模块)检验;方差齐性检验采用Levene方法;不同基因型的患者连续数据的比较采用多元方差分析方法。连续数据的相关分析采用Spearman方法,对组间的定性资料采用Fisher’s精确检验;回归分析采用二分类Logistic回归分析(全因素和后退法)以及多元线性回归(后退法)。轮廓分析(profile analysis)采用广义线性模型重复测量方法。数据分析采用SPSS13.0软件。P值小于0.05为检验具有统计学差异。结果1.参加新药注册临床试验的患者共54例,其中阿德福韦组31例,聚乙二醇干扰素-alpha组23例。在抗病毒治疗期间,与基线血清HBsAg水平比较,治疗12周、28(阿德福韦)或24(聚乙二醇干扰素-alpha)周和48周的血清HBsAg均有所降低;与治疗12周时血清HBsAg水平相比,治疗28或24或48周的血清HBsAg水平并没有显著下降;同样地,与28或24周比较,治疗48周时血清HBsAg也没有显著下降。分析同时期的血清HBV DNA水平变化发现,无论阿德福韦或者聚乙二醇干扰素-alpha治疗,HBV DNA水平下降主要发生在治疗开始后的头12周内:HBV DNA下降均数都超过4.0 lg拷贝/ml,而之后HBV DNA水平要么降低的很少(阿德福韦组下降均数为0.426 lg拷贝/ml,P=0.005),要么无显著下降(聚乙二醇干扰素-alpha组,P=0.078)。总体上讲血清HBsAg的下降并不是一个匀速过程,而是一个快速下降.缓慢变化的两相过程,且与HBV DNA的变化一致。2.符合血清HBV DNA持续下降定义的患者共39例,其中阿德福韦组22例,聚乙二醇干扰素-alpha组17例。HBV DNA持续下降时,血清HBsAg水平变化主要有三种类型:第一种类型称双相型:血清HBsAg水平下降主要地发生在治疗开始后的头12周,之后持续下降,但下降幅度不如治疗开始后的12周,占43.6%(17/39)。第二种类型为升高型(n=10):血清HBsAg水平在治疗的头12周内反而升高,之后血清HBsAg水平保持比较稳定的水平。第三种为波浪型:血清HBsAg水平在治疗的头12周有下降,但之后却发生反弹(即28或24周血清HBsAg高于12周,n=10)。在上述三种主要类型中,接受阿德福韦和聚乙二醇干扰素-alpha治疗的比例无显著区别(P=0.886);同样,HBeAg转阴的比例也与血清HBsAg变化类型无关(P=0.868)。血清ALT的变化与血清HBV DNA水平的变化相平行。3.共87例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者进入拉米夫定短期治疗的研究。HBV基因型检测结果为:43例为HBV/B感染,43例为HBV/C,1例未分型。所有患者血清HBV DNA水平都有下降,从基线的8.56(10gto拷贝/毫升,均数)下降至4.10 lg,幅度为0.75-7.80(均数为4.46,P<0.001)。同时,血清HBsAg水平也显著下降:从基线的3.74(10g10 IU/ml)下降至3.40(均数,P<0.001)。36/43例基因B型患者(83.7%)血清HBsAg下降,而在HBV/C患者中这种情形仅有22例,占51.2%,低于B基因型感染者(P=0.001)。轮廓分析表明两种基因型患者血清HBV DNA的变化趋势类似(P=0.121),但血清HBsAg的变化却不一致(P=0.002)。有32.2%(n=28)的患者血清HBsAg水平在治疗第12周时出现程度不等的上升,虽然同时期的HBV DNA水平显著下降:下降幅度介乎0.75-7.78 lg之间(中位数为3.93,P<0.001)。二分类Logistic回归分析(后退法)显示,决定治疗12周时血清HBsAg下降的独立影响因素为HBV/B感染(比数比值为4.083,95%可信区间为1.362-12.236,P=0.012)和基线血清HBsAg高水平(比数比值为2.587,95%可信区间为1.259-5.315,P=0.010)。4.共有45例患者符合HBV DNA快速和持久抑制的定义,并接受了至少3年的拉米夫定治疗。其中HBV/B感染者占21例,HBV/C感染者为24例。在拉米夫定长期持久抑制HBV复制的情况下,血清HBsAg转阴的机会很低(n=1,2.2%),但HBeAg转阴的机会很高(26/45)。轮廓分析平行性检验表明,HBeAg转阴组和HBeAg未转阴组血清HBsAg变换趋势一致(P=0.991)。主要有两种血清HBsAg变化类型:双相型(n=25)和稳定型(血清HBsAg水平在治疗期间变化很小,n=14)。二分类的Logistic回归分析(后退法)显示,基线血清HBsAg水平低(比数比值0.020,95%可信区间为0.002-0.743,P=0.040)和HBV/C感染(比数比值为8.206,95%可信区间为1.070-62.948,P=0.048)是血清HBsAg在拉米夫定长期治疗下呈稳定型变化的主要因素。5.横断面研究共有218例患者,其中男性占181例,HBeAg阳性160例。HBV/B患者121例,C型患者97例;两种基因型的患者性别比例、年龄、ALT水平以及HBV DNA负荷无差别,B型患者血清HBsAg水平较C型高。血清HBsAg水平的影响因素主要为血清HBV DNA负荷、基因型和患者的性别,而患者年龄、同期的ALT水平以及HBeAg血清学状态对其无显著影响。应用多元线性回归(后退法)以血清HBsAg(1g IU/ml)为应变量进行回归分析,最后一步的结果表明:患者的性别、血清HBV DNA水平以及HBV基因型是影响血清HBsAg水平的主要因素。从标准回归系数的大小判断,血清HBV DNA负荷对血清HBsAg的水平影响最大。6.每对转染试验的细胞上清HBsAg水平都是HBV/B高于C型。HBV/B复制质粒细胞上清HBsAg水平高于C型(P<0.001);HBV/B细胞内HBsAg水平高于C型(P<0.001)。成功构建6种置换质粒。转染置换质粒,比较细胞内外HBsAg水平,表明HBsAg表达水平的主要决定因素是HBsAg的启动子区域。主要结论1.在观察HBeAg阳性患者接受阿德福韦或聚乙二醇干扰素-alpha治疗时发现,血清HBsAg水平总体上呈双相下降:血清HBsAg水平的下降主要发生在治疗的头12周,而之后血清HBsAg的下降呈平台样变化。2.以个体患者的血清HBsAg变化轮廓来分析,发现血清HBsAg的水平变化并不总是与血清HBV DNA负荷的变化平行:至少主要存在上升型(血清HBsAg水平在HBV DNA负荷下降时呈上升趋势,约占1/4)和波浪型(血清HBsAg水平在治疗期间先降后升,虽然HBV DNA负荷持续下降,约占1/4)。当然,主要的类型还是血清HBsAg与HBV DNA水平的变化相一致(约占1/2)。3.对87例拉米夫定治疗的HBeAg阳性患者进行12周的观察,有1/3的患者血清HBsAg没有下降,虽然HBV DNA下降显著。HBV/B患者血清HBsAg的变化和HBV DNA平行,而HBV/C则主要表现为血清HBV DNA下降而HBsAg水平上升。回归分析发现,基线HBsAg水平高和HBV/B的患者治疗时血清HBsAg水平下降的几率更大。4.进一步对45例HBV复制充分抑制的患者进行为期3年的观察,发现血清HBsAg水平总体上呈L型变化。虽然HBV DNA持续阴性,HBsAg转阴率并没有逐渐增加。HBV基因型和基线HBsAg水平是影响血清HBsAg水平变化趋势的独立因素。血清HBsAg水平主要呈双相下降或长时间持续稳定两种变化类型。5.我们对218例未接受抗病毒治疗的患者进行调查,发现血清HBsAg水平总体上和HBV DNA负荷呈正相关,男性血清HBsAg水平高于女性,HBeAg阳性患者高于HBeAg阴性患者,HBV/B型患者血清HBsAg水平高于C型。回归分析显示HBV DNA负荷、患者性别和HBV基因型是影响血清HBsAg水平的主要因素。本研究的回归分析结果显示HBeAg血清学状态对HBsAg水平的影响不显著。6.将HBV/B和C型的HBV复制质粒转染Huh7细胞,发现HBV/B细胞培养上清和细胞内HBsAg水平均高于C型。提示HBWB转染后HBsAg的表达水平高于C型。7.置换试验的结果显示,HBsAg启动子区域决定着HBsAg的表达水平:HBV/B的HBsAg启动子导致上清HBsAg和细胞内HBsAg升高;相反,HBV/C导致上清和细胞内HBsAg水平下降。提示HBV基因型影响HBsAg水平的功能区域为HBsAg的启动子序列。