论文部分内容阅读
我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,在NCBI的Genbank数据库中进行比对,结果在序列和结构上与其它物种的Ba.inlubtor-1基因具有较高的相似性,推测可能是家蚕Ba.inhibitor-1蛋白基因,我们把这一cDNA序列命名为BmBI-1(Bomby.ba.inhibitor-1)基因,GenBank登录号为DN237509。生物信息学分析表明,该基因编码235个氨基酸,等电点是9.213,含有两个保守结构域,分别是Ba.inhibitor-1-like家族和Ba.inhibitor-1-like超家族,跨膜结构和二级结构预测都表明该蛋白具有6个明显的跨膜结构域,具有很强的疏水性,这一点从疏水性预测分析中也可以看出;功能预测表明,该蛋白很可能位于细胞内膜上,作为通道蛋白对细胞凋亡起重要的调节作用。在多序列比对中,我们发现该基因具有很高的保守性,特别是在跨膜区域与其他物种之间有很高的相似性,这可能是因为跨膜区域与该蛋白在细胞内膜上的定位和通道的形成过程中起到关键的作用,并作为通道蛋白发挥作用。
为了研究BmBI-1的功能,通过PCR的方法获得了该基因的ORF,并克隆到载体pET-28a(+)中,成功重组原核表达质粒pET-28a(+)-BmBI-1,并转化感受态细胞E.col.BL21(DE3),经IPTG诱导表达后用SDS-PAGE检测,与阴性对照相比在29kDa处有一特异性条带,与预期值相符。重组蛋白以可溶的形式表达,通过分子筛和亲和层析纯化了重组蛋白,并使用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,效价大于1:12800。用重组菌表达的总蛋白做Wester.blot检测呈一条带。利用多克隆抗体对家蚕细胞Bm5进行亚细胞定位研究,初步确定BmBI-1定位于内质网等细胞器上。
同时,用荧光定量PCR和wester.blot的方法分析了不同组织及发育时期该基因的表达差异,定量内参选用18.rRNA,结果显示在各组织中BmBI-1表达量从高到底依次是马氏管、睾丸、头、肠、气门、表皮、脂肪体、丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是幼虫,再次是蛹,而在卵中却几乎没有检测到该蛋白。