研究背景缺血性心脏病一直是全球范围内引起致残的最主要原因和致死的首位原因。缺血再灌注损伤是造成该病发病率和死亡率升高的主要因素之一。缺血再灌注损伤的典型表现之一就是心律失常。因此,寻找一种预防改善缺血再灌注所引起的心律失常具有重要价值。针刺在预防和治疗疾病中发挥着积极的意义。临床研究证实,对于心肌缺血患者的临床症状,针刺能够达到改善的效果;同时,针刺能够明显的抑制心律失常的发生。基础研究也表明,针刺预处理可降低心律失常评分。本研究室以往的工作表明,电针能抑制心肌缺血性心律失常,而有关电针抗缺血再灌注性心律失常的机制,迄今鲜有人涉足。现代医学研究提示:κ-阿片受体（κappa opoid receptor,κ-OR）系统对于心血管系统生理、病理活动具有重要的调控作用;另一方面,针刺镇痛研究表明,针刺可以调节阿片受体表达、激活阿片受体系统,然而,阿片受体系统在针刺改善缺血再灌注心律失常效应机制中是否存在特异性的介导作用尚不清楚。本研究室前期研究表明:电针可改善心肌缺血性损伤,而κ-阿片受体特异性阻断剂可以部分阻断电针改善心肌缺血性损伤的保护效应,提示电针极有可能通过调节κ-OR及其受体后信号转导通路而改善缺血再灌注性心律失常,而将阿片受体及其信号转导路径的探讨引入到针刺改善心律失常的机制中的相关研究尚属空白。研究目的及意义观察电针对缺血再灌注性心律失常的保护作用,同时确定κ-OR是否参与介导电针干预的保护作用;并在此基础上探讨κ-OR后信号通路介导电针抗缺血缺血再灌注心律失常的机制。研究的完成不仅对于针刺防治缺血再灌注性心律失常的应用具有重要意义,亦将为系统探讨针刺心血管效应作用规律及其机制找到一条新思路或新的切入点。研究方法本实验总共分为两个部分进行:第一部分将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、电针组、阻断剂组通过观察心律失常评分。第二部分实验将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、电针组。在再灌注结束后,取大鼠心脏左心室做western Blot检测κ-OR、Gq蛋白;酶联免疫吸附试验（Elisa法）观察各组大鼠心肌组织中三磷酸肌醇（IP3）、二酰甘油（DAG）、（cAMP）含量的变化;Forskolin（AC 激动剂）、8-Br-cAMP（PKA激动剂）、BayK-8644（L-Ca2+激动剂）、PMA（PKC激动剂）等κ-阿片受体后信号转导成分在激动剂的作用下,观察单个心肌细钙离子变化。探讨κ-OR后信号通路上哪些信号分子参与介导电针抗缺血再灌注性心律失常。研究结果1 电针改善缺血再灌注性心律失常疗效的确定与NC组相比,M组再灌注时的和EA组心律失常评分显著性升高（P<0.01）,而经过电针干预后,EA组较M组再灌注时的心律失常评分与M组比较显著性降低（P<0.01）,而在电针前给与κ-OR特异性拮抗剂——Nor-BNI,其再灌注时的心律失常评分组较与NC组和EA组比较均有心律失常评分明显升高增加（P<0.05或P<0.01）。2 κ-OR及其受体后信号通路在参与介导电针抗缺血再灌注心律失常中的作用2.1 κ-OR及其受体后直接信号通路在参与介导电针抗缺血再灌注心律失常中的作用2.1.1电针对心肌缺血再灌注大鼠κ-OR蛋白的影响M组κ-OR蛋白含量与NC组比较有所增加（P<0.05）,考虑是心肌对缺血再灌注损伤的一种应激保护性反应;而EA组κ-OR蛋白含量与NC组和M组比较均有更为明显地增加（P均<0.01）。2.1.2电针对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织Gq蛋白的影响与NC组比较,M组Gq蛋白的表达略有增加（P<0.05）;而EA组Gq蛋白的表达与NC组和M组比较均有进一步的增加（P均<0.01）。2.1.3电针对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织中IP3的影响M组IP3的含量与NC组比较有所增加（P<0.01）;而EA组IP3的含量与NC组和M组比较均有明显增加（P均<0.01）。2.1.4电针对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织中DAG的影响与NC组比较,M组DAG的表达有增加趋势,但无统计学差异;而EA组DAG的表达与NC组和M组比较均有明显增加（P均<0.01）。2.1.5 电针对模拟全心缺血再灌注大鼠心肌细胞PKC反应性的影响2.1.5.1单个心肌细胞在PKC激动剂-PMA作用下钙瞬变情况电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在PKC激动剂--PMA作用下钙瞬变的影响各组钙瞬变波形的波幅在PKC激动剂-PMA作用下均有不同程度的升高。与NC组相比,M组心肌细胞在PKC激动剂-PMA作用下钙瞬变幅度变化明显增加（P<0.01）;与M组相比,经过电针后EA组增加的幅度减低（P<0.01）。2.1.5.2电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在PKC激动剂-PMA作用下收缩幅度的变化NC组与本组的Control相比较,心肌细胞在PKC激动剂-PMA的激动下收缩幅度增加40.00%,而M组与本组Control相比较,心肌细胞在PKC激动剂-PMA的激动下收缩幅度增加83.73%（P<0.01）。EA组与本组Control相比较,心肌细胞在PKC激动剂-PMA的激动下收缩幅度增加31.79%,明显低于M组。2.2 κ-阿片受体后间接信号通路在参与介导电针抗缺血再灌注心律失常中的作用2.2.1电针对模拟全心缺血再灌注大鼠心肌细胞AC反应性的影响2.2.1.1电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在AC激动剂-Forskolin作用下钙瞬变情况各组钙瞬变波形的波幅在AC激动剂-Forskolin的作用下均有升高。与NC组相比,M组心肌细胞在AC激动剂-Forskolin作用下钙瞬变幅度变化明显增加（P<0.01）。与M组相比,经过电针后EA组增加的幅度减低（P<0.01）。2.2.1.2 电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在AC激动剂-Forskolin作用下收缩幅度的变化NC组与本组的Control相比较,心肌细胞在AC激动剂-Forskolin的激动下收缩幅度增加21.16%,而M组与本组Control相比较,心肌细胞在AC激动剂-Forskolin的激动下收缩幅度增加57.91%。与本组Control相比较,EA组心肌细胞在AC激动剂-Forskolin的激动下收缩幅度增加30.50%,明显低于M组。2.2.2电针对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织cAMP的影响M组cAMP与NC组比较有所增加,无统计学差异;而EA组cAMP与M组比较有明显降低（P<0.01）。2.2.3 电针对模拟全心缺血再灌注大鼠心肌细胞PKA反应性的影响2.2.3.1电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在PKA的激动剂--8-Br-cAMP作用下钙瞬变的情况各组钙瞬变波形的波幅在PKA的激动剂--8-Br-cAMP作用下均有不同程度的升高。与NC组相比,M组心肌细胞在PKA的激动剂--8-Br-cAMP作用下钙瞬变幅度变化明显增加（P<0.01）。与M组相比,经过电针后EA组增加的幅度减低（P<0.01）。2.2.3.2电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在PKA的激动剂-8-Br-cAMP作用下收缩幅度的变化NC组与本组的Control相比较,单个心肌细胞在PKA的激动剂--8-Br-cAMP的激动下收缩幅度增加58.72%,而M组与本组Control相比较,心肌细胞在PKA的激动剂--8-Br-cAMP的激动下收缩幅度增加90.87%。EA组与本组Control相比较,心肌细胞在PKA的激动剂--8-Br-cAMP的激动下收缩幅度增加20.63%,明显低于M组。2.2.4电针对模拟全心缺血再灌注大鼠心肌细胞L-型钙离子通道反应性的影响2.2.4.1电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在L-型钙离子通道激动剂--Bay-K8644作用下钙瞬变情况各组钙瞬变波形的波幅在L-型钙离子通道激动剂--Bay-K8644作用下均有不同程度的升高。与NC组相比,M组心肌细胞在L-型钙离子通道激动剂-Bay-K8644作用下钙瞬变幅度变化明显增加（P<0.01）;与M组相比,经过电针后EA组增加的幅度减低（P<0.01）。2.2.4.2电针对模拟全心缺血再灌注大鼠分离的单个心肌细胞在L-型钙离子通道激动剂--Bay-K8644作用下收缩幅度的变化NC组与本组Control相比较,心肌细胞在L-型钙离子通道激动剂-Bay-K8644的激动下收缩幅度增加40.01%,而M组与本组Control相比较,心肌细胞在L-型钙离子通道激动剂--Bay-K8644的激动下收缩幅度增加86.01%。EA组与本组Control相比较,心肌细胞在L-型钙离子通道激动剂--Bay-K8644的激动下收缩幅度增加25.11%,明显低于M组。研究结论:1、电针可以降低缺血再灌注大鼠心律失常的发生,κ-OR特异性阻断剂nor-BNI能够部分阻断电针降低缺血再灌注大鼠心律失常发生的保护效应。提示:κ-OR可能参与介导了电针改善缺血再灌注引发心律失常的保护效应。2、电针干预的具体作用机制一方面可能是通过增加κ-OR含量,继而作用于κ-OR后直接作用的信号转导系统相关站点,即增强Gq、IP3及DAG的表达、抑制PKC的过度激活;另一方面,通过抑制间接作用信号转导通路相关站点即下调cAMP含量、抑制AC、PKA、L-Ca2+通道的过度激活,发挥抗缺血再灌注性心律失常的作用。