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研究目的近年来,我国患有老年痴呆的患者近500万人,约占世界总病例数的1/4。其中血管性痴呆（vasculardementia.VD）是老年人痴呆的主要类型之一,在世界痴呆患者中占约30%的比例。VD在亚洲国家比较多见,目前为止,尚无有效治疗手段,却是可以预防的一种痴呆病症,并且需要在早期阶段进行防治。如果能在早期阶段给予积极干预,可取得良好的治疗效果。当归芍药散（DSS）由当归、白芍、川芎、白术、泽泻、茯苓6味中药组成,出自张仲景所著《金匮要略》,研究表明当归芍药散具有明显的扩张末梢血管的作用,因为脑血流、全身血循环的改善对痴呆的外周症状改善有较大影响,所以当归芍药散的治疗作用将会被进一步研究探讨;同时当归芍药散还具有脑代谢活化作用[14],所以在一定程度上可对阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）有改善作用,同时也对VD患者有改善作用。PI3K/Akt信号通路能够通过一系列反应参与并调节细胞生长、增殖、分化与迁移。miRNA是真核生物中长度为22-25nt的内源性单链非编码RNA。通过与靶向RNA14的3’-UTR结合,发挥降解或抑制作用。miRNA-124在神经细胞中表达丰富,可明显促进神经细胞的生长,研究表明降低miR-124可降低神经退行性变疾病中神经元的比例,限制增殖促进分化,本实验拟对当归芍药散对miRNA-124的作用,以及当归芍药散通过miRNA-124调节PI3K/Akt信号通路对血管性痴呆的作用进行探讨。研究方法1.SD大鼠,雄性±220g,随机分为7组:空白组、模型组、假手术组、阳性药组（尼莫地平组,9.45 mg·kg-1）及当归芍药散（DSS）高、中、低剂量组（6.4、3.2、1.6 g·kg-1）,每组11只,剩余三只备用。大鼠手术前禁食12 h,禁水4 h。采用10%的水合氯醛（3 mL·kg-1）进行腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术台上;以75%酒精进行颈部皮肤消毒,行颈部正中切口;钝性分离肌肉,分离颈总动脉与迷走神经;模型组、阳性药组及DSS高、中、低剂量组穿线结扎双侧颈总动脉,缝合伤口,假手术组分离迷走神经后不结扎直接缝合。在伤口处给予青霉素粉末预防感染,局部纱布覆盖。术后注意保暖,待动物清醒后,放回笼中饲养,随时观察状态。术后7 d,切口已完全愈合,饮食饮水正常;排除造模后死亡大鼠,每组剩余8只。各组大鼠按照上述剂量进行灌胃给药,空白组、假手术组、模型组给予等量生理盐水,每天1次,给药体积10 mL·kg-1,连续灌胃1个月。给药结束后进行水迷宫行为学检测;HE染色进行海马CAI区病理学检测;Western Blot法检测海马组织PI3K、Akt、p-Akt、LC3II/LC3I以及Bcl-2/Bax蛋白的表达;q-PCR检测给药后PI3K、Akt、miR-124相关基因的表达。2.昆明小鼠,雄性±20g,随机分成7组:空白组、模型组、假手术组、DSS组（5.12 g·kg-1）、DSS（5.12 g·kg-1）+miR-124（1×109TU/mL）抑制组（下简称 DSS+miR124组）、Model+miR-124（1×109 TU/mL）抑制组（下简称 miR-124 组）、Model+miR-124（1×109 TU/mL）阴性对照组（下简称miR-124（-）组）;小鼠手术前禁食12 h,禁水4 h。采用3.5%的水合氯醛（10 mL·kg-1）进行腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术台上;以75%酒精进行颈部皮肤消毒,行颈部正中切口;钝性分离肌肉,分离颈总动脉与迷走神经;模型组、DSS组、DSS+miR-124组、miR-124组、miR-124（-）组采用双侧颈总动脉反复缺血再灌注+断尾取血法建立血管性痴呆模型,微型血管夹夹闭颈总动脉20min后,打开血管夹通血流1Omin,反复三次,第一次夹闭5min时在距离鼠尾尖1cm处断尾,放血约0.3mL,热凝止血。假手术组分离迷走神经后不结扎直接缝合;缝合肌肉层后,给予青霉素抗感染;缝合切口,局部纱布覆盖。注意给大鼠保暖,待小鼠清醒后,放回笼中饲养,随时观察小鼠状态;术后5 d,切口已完全愈合,饮食饮水正常;排除造模后死亡小鼠,每组剩余8只。各组进行侧脑室注射,DSS+miR-124 组 miR-124 组每只小鼠注射 miR-124 inhibition 慢病毒 2μL,miR-124（-）组每只小鼠注射miR-124 inhibition阴性对照病毒2μL。各组小鼠按照上述剂量进行灌胃给药,空白组、假手术组、模型组、miR-124组、miR-124（-）组给予等量生理盐水,每天1次,给药体积10 mL·kg-1,连续灌胃1个月。给药结束后进行新物体识别、避暗实验、水迷宫等行为学检测;激光散斑血流监测系统检测小鼠脑血流分布情况;HE和尼氏染色进行海马CAI区病理学检测;Western Blot法检测海马组织PI3K、Akt、p-Akt、LC3II/LC3I 以及 Bcl-2/Bax 蛋白的表达;q-PCR 检测给药后 PI3K、Akt、miR-124相关自基因的表达。研究结果1.大鼠实验结果:（1）与假手术组比较,模型组第1-4天的逃避潜伏期均显著延长,穿越平台的次数显著减少（P<0.01）;PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达量均显著降低（P<0.05,P<0.01）,LC3-Ⅱ/LC3-I 值显著增高（P<0.0]）,Bcl-2/Bax 的比值显著降低（P<0.05）;PI3K、Akt mRNA 表达水平均显著升高（P<0.05）,miR-124 mRNA表达水显著升高（P<0.05）。（2）与模型组比较,DSS高中剂量组第1-4天的逃避潜伏期均明显缩短,穿越平台的次数明显增加（P<0.05,P<0.01）;DSS高剂量组的PI3K蛋白表达量显著升高（P<0.05）,DSS高、中剂量组的Akt蛋白表达量显著升高（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值显著升高（P<0.05）,DSS高、中、低剂量组的p-Akt蛋白表达量均显著升高（P<0.05,P<0.01）,DSS高、低剂量组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值明显降低（P<0.01）;DSS高、中剂量组的PI3K mRNA表达水平显著提高（P<0.05,P<0.01）,DSS中剂量组的Akt、miR-124 mRNA表达水平显著降低（P<0.05）。2.小鼠实验结果:（1）与假手术组比较,模型组第1-4天的逃避潜伏期均显著延长,穿越平台的次数显著减少（P<0.01,P<0.05）;PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达量均显著降低（P<00.05,P<0.01）,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值显著升高（P<0.01）,PI3K、Akt mRNA 表达水平均明显降低（P<0.01,P<0.05）。（2）与模型组比较,DSS+miR124组第1-4的逃避潜伏期均显著缩短（P<0.01）,穿越平台的次数明显增加（P<0.01）,DSS组、miR-124组第1天的逃避潜伏期无明显差异,第2-4天明显缩短（P<0.05）,DSS的穿越平台次数明显增加（P<0.01）;DSS、DSS+miR124 组、miR-124 组的 PI3K、Akt、p-AKT 蛋白表达量显著升高（P<0.05,P<0.01）,DSS、DSS+miR124 组、miR-124 组的 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值明显降低（P<0.05,P<0.01）;DSS、DSS+miR124 组、miR-124 组的 Bcl-2/Bax值明显升高（P<0.05,P<0.01）;DSS、DSS+miR124 组的 PI3K 和 Akt mRNA表达水平显著提高（P<0.05,P<0.01）,DSS、DSS+miR124 组对 miR-124 mRNA的表达水平显著提高（P<0.05,P<0.01）,miR-124对miR-124 mRNA的表达水平无明显影响。结论（1）当归芍药散可改善VD模型大鼠及小鼠的学习记忆能力;（2）当归芍药散可以调控PI3K、Akt、p-Akt等基因和蛋白的表达;（3）当归芍药散可在一定程度上可能调控Bcl-2/Bax等蛋白的表达,减少细胞凋亡,并且可以调控的LC3表达,阻滞细胞自噬;（4）当归芍药散可下调VD小鼠海马组织中miR-124的含量,调控PI3K/Akt信号通路,继而改善VD大小鼠的学习记忆能力;（5）当归芍药散可明显改善VD小鼠脑血流分布情况,促进脑部血液循环;（6）组织病理学观察显示,当归芍药散可明显减轻脑组织海马神经元、小胶质细胞的变性坏死,明显减轻大鼠海马脑组织损伤。