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感染与出血是急性白血病死亡的两大主要原因，在引起出血的诸多原因中，弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)的危害性最大。感染尤其是败血症休克可诱发DIC，而DIC形成后又进一步加重休克，最终导致多器官功能衰竭等严重并发症，病死率极高。大量的临床研究表明血浆纤维连接蛋白(fibronectin，FN)水平对于内毒素休克并发DIC的预后判断具有重要意义。败血症休克患者血浆FN水平明显而急剧降低，且DIC发生率高。给败血症患者补充富含FN的冷沉淀素，则在患者血浆FN恢复的同时，伴有心肺功能的改善及败血症的控制，DIC的发生率也下降。Barkagan等给106例败血症伴DIC患者输注富含FN的冷沉淀物，取得显著疗效。Brodin B等给28例严重感染住院患者补充冷沉淀物，观察血浆FN水平及DIC相关指标的变化，结果发现，患者血浆FN恢复正常，且无一例发生DIC，提示FN可用于败血症及DIC的替代治疗。有关FN对内毒素及DIC作用，目前尚不清楚。已知FN是一种大分子多功能糖蛋白，能跟肝素、胶原、纤维蛋白以及整和素家族的细胞表面受体结合，参与细胞粘附与迁移、止血过程、损伤修复等。FN分子的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽序列结构是主要细胞结合位点，FN通过RGD三肽序列同细胞表面整合素受体相结合并将细胞外信息传入细胞内，引起细胞发生一系列变化。除了RGD结构外，其周围序列对FN的功能产生重要的影响，如在尺GO序列上游111型重复序列中就存在一段对细胞粘附具有协同作用的序列。此外，尺GD结构周围的剪切加工位点如EI工IA区对细胞粘附同样具有协同作用。有关应用纯化和重组FN或其相关功能多肤治疗败血症及D工C，国内外均未见报道。本研究首先在建立鼠败血症及0[C模型的基础上，应用明胶亲和层析从血浆中纯化阳，研究其抗败血症及叭C的作用。然后构建重组人FN细胞结合位点功能区片段(I上el363一Tyr1725)，包含RGD序列及其上游FN3中细胞粘附协同序列以及EIHA区的原核表达载体，在大肠杆菌中表达，通过纯化得到重组FN细胞结合功能区多肤(rhFN55)，并经功能分析，为其用于败血症及OIC的治疗提供实验依据。本文的主要研究包括以下两方面:FN对鼠败血症及OIC模型的作用(1)采用明胶亲和层析法从正常人血浆纯化刚，经SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳及蛋白印迹法鉴定其纯度及特异性后，用EL工SA法测定其含量。(2)应用病理组织学、电镜观察超微结构、片段化DNA分析、盯一PCR、EL工SA法检测血浆FN对半乳糖胺增敏的内毒素血症小鼠的作用，初步探讨其作用机制。(3)应用.血细胞计数仪及血红蛋白凝集测定仪、病理组织学及ELISA法检测血浆刚对内毒素一诱导大鼠DIC作用，初步探讨其作用机制。2.rhl:N55对鼠败血症及D[C模型的作用(l)采用基因重组技术，构建表达rhFN55的原核表达载体，用505一聚丙烯酞胺凝胶电泳及蛋白印迹法鉴定其表达。(2)采用生物素亲和层析纯化rhFN55，经505一聚丙烯酞胺凝胶电泳鉴定其纯度后，用Bradford法测定其含量。(3)采用细胞粘附试验测定rhFN55及市售商品化FN多肤(G4393为FNS肤含RGD细胞结合位点;F3667为FNS月太对RGD具有粘附促进作用;FO793为刚12肤即FN 1 377一1388位于RGO上游对其具有粘附协同作用。)的细胞粘附能力，动物实验检测rhFN55及商品化FN多肤对半乳糖胺增敏的内毒素血症小鼠及内毒素诱导DIC大鼠的作用。取得如下结果及结论.采用明胶亲和层析法从正常人血浆纯化FN的纯度及特异性均高。2.FN能降低半乳糖胺增敏的内毒素血症小鼠的死亡率，半乳糖胺敏化内毒素小鼠的死亡率达80W0，刚治疗组小鼠的死亡率为20%。病理组织学观察发现半乳糖胺敏化内毒素小鼠肝细胞出现广泛坏死，而FN治疗组肝细胞仅见轻微坏死:电镜观察发现半乳糖胺敏化内毒素小鼠多数肝细胞呈凋亡性改变，刚治疗组肝细胞大小形态结构大致正常，未见凋亡细胞:ONA片段化分析半乳糖胺敏化内毒素小鼠肝细胞可见明显梯形降解DNA片段，FN治疗组则无:RT一PCR检测表明半乳糖胺敏化内毒素小鼠肝组织TNF。、儿一l旦、工L一6m尺NA表达水平均高于正常小鼠，FN治疗组小鼠肝组织TNFa、工L一l日、IL一6 mRNA表达水平则接近正常小鼠;队汇SA法检测发现半乳糖胺敏化内毒素小鼠血浆TNFQ表达水平显著增高，FN治疗组小鼠血浆‘「N厂。表达水平明显低于未治疗组。3.FN能纠下内毒素一诱导的大鼠O优，并降低大鼠血浆因内毒素所致TNFQ表达水平增高。4.成功构建rhFN55的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。5.采用生物素亲和层析纯化可获得高纯度rhFN55。细胞粘附实验表明。hFN55的细胞粘附能力高于商品化FN多肤;动物实验表明rhFN55处理的半乳糖胺敏化内毒素血症小鼠的存活率高于商品化FN多肤，病理组织学观察发现rhFN55处理的半乳糖胺敏化内毒素小鼠肝细胞仅见轻微坏死现象，而商品化刚多肤处理组小鼠肝细胞混浊肿胀，并出现明显坏死现象;rhFN55可以纠正L陀诱导的大鼠DIC，减轻DIC大鼠肺组织、肝组织血栓形成，其效果优于商品化FN多肤。说明FN分子中除RGD外，?