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目的: MLL5(Mixed Lineage Leukemia5)蛋白是MLL(又称KMT2)蛋白家族的一员,MLL蛋白家族主要通过参与组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)的甲基化发挥生物学功能.研究表明,MLL5不同于家族其他成员,由于其SET结构域有一系列保守氨基酸序列的变化,其在生物活体内不表达组蛋白甲基转移酶的生物活性.因此,在不同生物体的中有关其生理功能及作用机制的研究是很有意义的.近年来,关于MLL5的功能研究表明其在人体广泛存在并发挥多种生理功能,如参与调控细胞周期进程,维持基因稳定性,促进成人造血功能及精子生成等.据本实验室RNA-seq数据及多个数据库的信息显示,Mll5在C57BL/6小鼠视网膜中有着高富集表达,然而目前没有任何关于Mll5在视网膜中的功能研究报道.基于此,我们获得了已构建的C57BL/6背景Mll5敲除小鼠进行视网膜功能及形态学相关的表型分析研究.本研究旨在阐明Mll5在小鼠视网膜发育过程中的功能,并为Mll5在小鼠视网膜可能存在的调控机制的深入研究提供证据基础. 方法: 1.基因型鉴定 本研究中所用小鼠模型为C57BL/6遗传背景,使用CRISPR/Cas9技术进行基因打靶,将Mll5基因的第三号外显子的8个碱基敲除,造成了移码突变,大部分Mll5蛋白无法正常表达.我们设计了针对敲除碱基的不同对引物用于小鼠基因型鉴定.鉴定方法为:剪取小鼠脚趾或鼠尾并提取其DNA,将DNA使用不同的引物经过PCR扩增后进行电泳跑胶,根据条带的有无来鉴定基因型. 2.视网膜电图检测 使用美国Phoenix公司的MicronIV视网膜影像系统分别对Mll5敲除纯和小鼠,杂合小鼠及野生型小鼠进行局部视野视网膜电图检测.给予的光刺激参数符合国际ISCEV标准. 3.HE染色 使用HE染色技术对冰冻切片染色,使用高倍光学显微镜拍照. 4.细胞凋亡染色 为了验证Mll5基因敲除小鼠能够导致感光细胞凋亡,我们进行了视网膜切片的凋亡染色.我们采用Promega 公司的DeadEnd? Fluorometric TUNEL System试剂盒进行实验.染色封片后进行使用激光共聚焦显微镜拍照. 5.免疫荧光染色 取新鲜的小鼠眼球组织,使用4%多聚甲醛液灌注固定后,30%蔗糖脱水,迅速加入OCT包埋,液氮冰冻制作冰冻切片.取组织结构保存完好的切片进行抗体封闭,一抗及二抗染色,DAPI染色并洗脱后树脂封片,使用激光共聚焦显微镜拍摄照片. 6.实时荧光定量核酸扩增检测 使用实时荧光定量核酸扩增检测试验检测Mll5在小鼠各个组织的mRNA表达量,并检测小鼠在发育各个时间段Mll5的表达水平,为进一步的表型检测设立合理的时间点提供依据.根据我们获得的功能及形态学表型,使用实时荧光定量核酸扩增检测技术验证Mll5可能影响的基因及其上游的调控基因. 7.蛋白质印迹实验 为了验证Mll5在蛋白水平与Rhodopsin及Crx具有相关性,我们进行了蛋白质印迹实验.利用凝胶成像系统拍照,ImageJ软件分析灰度图. 结果: 1.Mll5表达于C57BL/6成年小鼠的各组织,其中在小鼠的视网膜中含量最高.小鼠视网膜中的Mll5表达量随着发育过程平稳减少,出生后第五天表达量最高. 2.视网膜电图检测小鼠视功能显示Mll5敲除小鼠的明适应及暗适应刺激反应强度下降,明适应刺激反应激发时间延迟,提示小鼠的视杆及视锥细胞功能受到损伤,视锥细胞信号转导通路可能受到影响. 3.凋亡细胞染色实验显示敲除小鼠视网膜的外核层出现阳性凋亡信号,提示Mll5对于维持视网膜感光细胞存活有着重要作用. 4.Mll5敲除小鼠的视网膜结构发生扭曲紊乱,视杆细胞的抗Rhodopsin荧光信号强度下降,视锥细胞的形态发生异常,分布密度减少. 5.实时荧光定量核酸扩增实验表明Mll5敲除小鼠的Rhodopsin,Opn1mw及Opn1sw的mRNA表达下降,Otx2,Crx,Nrl及Nr2e3等转录因子的mRNA表达水平未见改变,提示Mll5可能通过其他途径调控Rhodopsin,Opn1mw及Opn1sw的表达. 结论: Mll5作为小鼠全身多器官表达的基因,其缺失会导致严重的发育不良.在本研究中,我们观察到Mll5敲除小鼠的暗适应及明适应功能受损,视网膜结构发生严重扭曲,部分感光细胞发生了凋亡.存活的视杆、视锥细胞发育不良,数量减少,形态异常.本研究的实验结果从功能,结构及基因转录水平阐明了Mll5对于小鼠感光细胞的正常发育和维持有着重要的作用.同时本研究未发现Mll5与感光细胞的部分上游转录因子的相关性,提示Mll5可能通过其他基因或表观遗传学途径调控Rhodopsin,Opn1mw及Opn1sw的表达.