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研究背景和目的Akt／PKB是一种丝／苏氨酸蛋白激酶,处于多条信号通路的重要交叉点,调控细胞生长与存活、增殖与凋亡,糖类代谢、基因转录、新生血管形成、细胞迁移运动以及细胞周期调控等,体内许多疾病如肿瘤的发生发展均与它的异常激活密切相关。深入研究Akt有助于疾病发病机制的探讨和诊断治疗。RNAi是一种可高效、特异地下调目标基因的表达、并在基因功能研究和基因治疗领域有着广阔应用前景的技术。而构建目的基因的RNAi的有效表达载体则是实现这一目标的前提。为此,本研究构建针对人Akt基因的shRNA真核表达载体,分别在RNA水平和蛋白水平检测Akt在肿瘤细胞中的基因沉默情况。旨在为下一步深入研究Akt作用机制和构建慢病毒表达载体结合RNAi技术预防和治疗结肠癌、肝癌等恶性肿瘤提供实验基础。研究方法第一部分：Akt siRNA的设计合成及U6入门载体的构建。获取人Akt mRNA基因序列,设计合成2条针对Akt mRNA的特异性干扰序列(1#shRNA、2#shRNA),1条线虫的特定序列作为阴性对照序列(sh-NC)。将3条ss oligo退火合成dso1igo,克隆到入门载体pENTRTM／U6的黏性末端,构建出pENTRTM／U6-Akt shRNA入门载体(简称为U6入门载体),转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞,卡那霉素抗性平板筛选、挑取阳性克隆做菌落PCR初步鉴定,最后测序分析鉴定。第二部分：结肠癌、肝癌细胞的培养、转染和U6入门载体干扰效果的验证。通过换液、消化、传代、每5代液氮冻存等常规培养,培养生长稳定状态良好的肝癌和结肠癌细胞株。用脂质体Lipofectamine2000将测序正确的3个入门载体(分别标记为U6-1#、U6-2#,U6-NC)瞬时转染入细胞,分别在24h和48h提取总RNA和蛋白,RT-PCR检测Akt mRNA表达水平,western bolt检测Akt蛋白表达水平。观察分析Akt基因表达水平的变化差异。第三部分：pLenti6/BLOCK-iT-DEST目的表达载体的构建和干扰效果的验证。将构建成功的U6入门载体与目的表达载体进行LR位点特异性重组(重组体为pLenti6/BLOCK-iT-Akt shRNA目的表达载体,分别标记为pL-1#、pL-2#,pL-NC)),转化入Stb13大肠杆菌感受态细胞,用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆,菌落PCR初步鉴定后测定序列。同样,用脂质体转染将重组质粒导入肿瘤细胞,检测Akt基因的表达变化。结果第一部分：ds oligo退火完整性检测良好,Akt shRNA与U6载体顺利连接转化后,抗性筛选出若干阳性克隆,菌落PCR扩增出相应分子量的条带。测序分析完全正确,成功构建出pENTRMTM／U6入门载体介导的表达Akt shRNA的质粒(pENTRM TM/U6-Akt shRNA)。第二部分：肝癌和结肠癌细胞株均生长稳定、状态良好。RT-PCR显示：在内参照GAPDH丰度基本相同的情况下,与NC(未转染阴性对照)相比,U6-1#、U6-2#条带明显较弱,且U6-1#比U6-2#更弱,干扰效果更好；转染后48h Akt蛋白表达量高于转染后24h蛋白表达量,内参基本相同情况下,U6-1#、U6-2#蛋白表达量比NC明显下调,且U6-1#比U6-2#下调更显著,与RT-PCR结果一致。第三部分：位点特异性重组后成功构建出携带靶基因干扰片段的pLenti6/ BLOCK-iT-Akt shRNA目的表达载体,抗性筛选出阳性克隆,菌落PCR扩增出相应分子量条带,测定序列正确,RT-PCR检测,与NC和sh-NC(阴性对照序列)相比,pL-1#、pL-2#条带明显变弱,且前者下调Akt更显著。结论实验成功构建了Akt的U6入门和目的表达载体介导的Akt shRNA真核表达系统,为构建慢病毒表达载体,进一步研究Akt的基因功能和生物学效应,探讨疾病作用机制奠定基础。在本实验应用的肝癌和结肠癌细胞株中,所设计Akt 1#shRNA特异性干扰Akt基因和蛋白的表达,具有较好的基因沉默效果。