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腈水合酶催化腈类化合物生成相应的酰胺类化合物,在工业生产丙烯酰胺、烟酰胺等化合物方面具有重要的应用。腈水合酶特异性高,利用其生产酰胺能耗低、副产物少。但是游离的腈水合酶稳定性差、易失活、难以回收利用,将酶固定化可以很好地解决上述问题。氧化硅材料是最为常见的固定化酶载体之一,它形式多样、无毒害、生物相容性好,被认为是适用于酶固定化的较为理想的载体。本研究以钴型腈水合酶ES-NHT-118为模型酶,以氧化硅材料为载体,分别采用包埋法和固载化交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)的方法进行酶的固定化。对固定化酶的制备过程、催化性能和稳定性进行研究,并将两种氧化硅固定化腈水合酶用于烟酰胺的制备。主要内容如下:(1)仿生氧化硅包埋固定化腈水合酶(Encapsulated NHase)的制备以及性能研究。以正硅酸甲酯为前驱体,聚二甲基二烯丙基氯化铵为催化剂,温和快速地实现腈水合酶的包埋。固定化酶的颗粒直径约为100 nm,包埋率高于98.0%,酶活回收率为26.7%。考察了游离酶与固定化酶的热稳定性、pH稳定性、操作稳定性以及储藏稳定性。与游离酶相比,Encapsulated NHase的稳定性有了明显的提高。同时,Encapsulated NHase显示了良好的重复使用性能。(2)介孔氧化硅固载化腈水合酶交联酶聚集体(NHase-CLEAs@MOS)的制备及性能研究。以洋葱状介孔氧化硅(MOS)这一新型氧化硅材料为载体,首先吸附腈水合酶,再以葡聚糖醛为交联剂进行交联。从透射电镜图可以看出,MOS具有清晰的弯曲的多层结构,每层间距约为15 nm。优化的制备条件如下:腈水合酶浓度0.0262mg/m L,葡聚糖醛浓度1.43 mg/m L以及交联时间2 h,酶活回收率可达48.2%。考察了游离酶和固定化酶的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性以及储藏稳定性。实验结果表明,NHase-CLEAs@MOS的稳定性优于游离酶,且与仅吸附不交联的固定化酶(NHase@MOS)相比,机械稳定性明显提高。同时,与常见的介孔氧化硅材料SBA-15相比,以MOS为载体的固定化酶对底物丙烯腈的亲和能力更高。以Encapsulated NHase和NHase-CLEAs@MOS为催化剂水合3-氰基吡啶制备烟酰胺。优化的制备条件为反应温度40 oC,pH 7.0,腈水合酶活性4.36 U。Encapsulated NHase的重复使用性能优于NHase-CLEAs@MOS。通过动力学分析,Encapsulated NHase和NHase-CLEAs@MOS的Km值分别为100 mmol/L和134 mmol/L。