蜜蜂是一种高度社会化的昆虫,具有很高的经济价值和生态作用。目前,由于营养不足、自然栖息地的丧失、螨虫的侵袭、遗传多样性的丧失、杀虫剂和特异的疾病等原因,全世界饲养的蜜蜂蜂群正面临着严重的威胁,蜂群数量正在急剧下降。白垩病是由昆虫病原真菌蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）引起的一种世界性的蜜蜂病害,也是造成全世界,尤其是中国养蜂业重大损失的重要原因。由于白垩病引起蜂群数量的大量减少,以及随之带来的巨大经济损失,研究人员开始寻找防治蜜蜂疾病的新策略,其中包括对致病菌致病机制的分子生物学研究。目前,基因工程技术是该研究的首选技术手段,即通过发现致病基因可能的作用机制,对白垩病进行生物防控。基于此,根据实验室的前期工作基础,本研究采取CRISPR/Cas9基因编辑技术对蜜蜂球囊菌的4个基因功能进行了研究,为今后开发防控蜜蜂白垩病新方法,提高蜜蜂的健康水平奠定基础。主要研究结果:1.从中国3个省的4个不同蜂场收集了蜜蜂球囊菌菌株4个,采用ITS序列测序方法验证了物种特异性,梯度培养的方法明确了蜜蜂球囊菌菌株对潮霉素B的敏感浓度为25μg/ml。2.在前期研究的基础上,选择了4个与蜜蜂球囊菌致病相关基因进行了功能验证。包括:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白基因（Nicotinamide Adenine Dinucleotide binding protein,NAD（P））、杂色曲霉素A还原酶基因（Versicolorin reductase,StcU-2）,杂色曲霉素8-O-甲基转移酶基因（Sterigmatocytin 8-O-methyl transferase,OmtA）以及超级杀伤蛋基因（Super killer protein 3,Ski3）。根据前间区序邻近基序设计并合成了相关基因的sgRNA引物。3.优化了蜜蜂球囊菌原生质体再生条件。获得了原生质体最优制备条件为:以培养24 h的蜜蜂球囊菌纯孢子、马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PIDB）培养24-36 h获得的幼龄菌丝为材料,崩溃酶为消化酶,可获得更高质量的原生质体,原生质体产量约为6.71×107 mL-1,再生率>90%。。4.优化了蜜蜂球囊菌遗传转化条件。40%PEG4000、1 mol/L山梨醇的STC溶液介导原生质体转化,CRISPR/Cas9的转化效率最高,选取的4个基因都获得了100个（0.011%）以上具有潮霉素B抗性的原生质体转化子。5.采用潮霉素B抗性筛选实验、激光扫描显微镜分析、CRISPR/Cas9载体特异性标记EGFP和hph的PCR检测以及测序等5种方法对基因编辑的结果进行了检验,结果表明,本实验获得了2个靶向基因NAD（P）和StcU-2的14个阳性转化子,从中各选取8个突变株进行下一步分析。6.发现蜜蜂球囊菌会因选取的前间区序列不同,以及转化介质浓度不同而表现出不同的基因编辑结果。NAD（P）和StcU-2转化得到的蜜蜂球囊菌突变体均表现出产孢功能明显下降,无功能的孢囊数量增多,推测NAD（P）和StcU-2两个基因与蜜蜂球囊菌的生殖发育相关。7.对突变菌株的致病性进行了研究。结果表明,获得的突变株与初发菌相比在致病指数及发病率上明显下降,差异极显著。综上所述,本实验首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对蜜蜂球囊菌致病基因进行编辑,获得了突变体,为今后深入研究蜜蜂球囊菌致病基因的功能,有效控制疾病,提供了参考依据。