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实验目的:通过建立肺炎链球菌性脑膜炎(Streptococcus pneumoniae meningitis,SPM)小鼠的模型,研究髓样相关蛋白MRP8/14(Myeloid Related Protein 8/14)对炎症小体NLRP3/NLRC4信号表达的影响,为探索SPM免疫炎症反应的调控机制提供新的实验思路及依据。实验方法:1、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)混悬液的制备:SP-Ⅲ型标准菌株ATCC-6303,放置在水浴锅,设置37℃过夜,复苏菌株,接种于血琼脂培养基上,制成浓度为4.5× 108CFU/ml的SP混悬液。2、SPM小鼠的模型建立:SPF级健康雄性BALB/C小鼠,48只,6-8周龄,小鼠随机分为4组:PBS组(磷酸盐缓冲液组)、MRP8/14组、SP组、SP+MRP8/14组。侧脑室途径注射PBS液40μl+SP混悬液5μl(SP浓度为4.5× 108CFU/ml),建立SPM小鼠模型。各组小鼠均采用侧脑室途径注射,PBS组注射PBS液45μl,MRP8/14组注射MRP8/14蛋白40μl(蛋白浓度为0.5μg/μl)+PBS液5μl,SP组注射PBS液40μl+SP混悬液5μl,SP+MRP8/14组注射MRP8/14蛋白40μl(蛋白浓度为0.5μg/μl)+SP混悬液5μl。3、各组小鼠侧脑室注射后,分别于6h、24h、48h进行:(1)神经行为学评分:依据Loeffler神经行为学五分制评分:5分:抓住背部能正常活动,5秒内翻身成功;4分:自主运动减少,5秒内能翻身;3分:可以翻身成功,但时间超过5秒;2分:不能翻身;1分:不能运动;0分:死亡。(2)体重的减少量测定:称量各组小鼠侧脑室注射前的体重,侧脑室注射后6h、24h、48h的体重,分别统计体重的减少量。(3)各组小鼠麻醉后处死,取一半脑组织,HE染色观察脑组织的炎症变化。(4)剩余的脑组织制备脑匀浆标本提取总RNA,逆转录后Real-time PCR方法检测脑组织中NLRP3、NLRC4、IL-1β、Gasdermin D的mRNA的相对表达量。实验结果:1、神经行为学评分(分):MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(5.000±0.000)vs(5.000±0.000)、24h(4.750±0.500)vs(5.000±0.000)、48h(5.000±0.000)vs(5.000±0.000),差异均无统计学意义(P>0.05);SP组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(5.000±0.000)vs(5.000±0.000)、24h(3.750±0.500)vs(5.000±0.000)、48h(3.250±0.957)vs(5.000±0.000),在 24h、48h 明显减低,差异有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14组小鼠与 SP 组小鼠相比,6h(4.750±0.500)vs(5.000±0.000)、24h(2.500±0.577)vs(3.750±0.500)、48h(1.250±0.957)vs(3.250±0.957),在 24h、48h 进一步减低,差异有统计学意义(P<0.05)。2、体重的减少量测定(g):MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(0.503±0.098)vs(0.518±0.126)、24h(1.020±0.417)vs(1.255±0.495)、48h(1.600±0.553)vs(1.293±0.527),差异均无统计学意义(P>0.05);SP组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(0.615±0.085)vs(0.518±0.126)、24h(1.990±0.174)vs(1.255±0.495)、48h(2.187±0.180)vs(1.293±0.527),在24h、48h体重的减少量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14 组小鼠与 SP 组小鼠相比,6h(0.653±0.059)vs(0.615±0.085)、24h(2.622±0.440)vs(1.990±0.174)、48h(3.295±0.628)vs(2.187±0.180),在 24h、48h体重的减少量进一步增加,差异有统计学意义(P<0.05)。3、脑组织HE染色:MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,在6h、24h、48h的脑膜结构均正常,均未见充血和炎症细胞;SP组小鼠与PBS组小鼠相比,6h软脑膜稍充血,蛛网膜下腔稍扩张;24h软脑膜明显充血,蛛网膜下腔明显扩张,可见少数炎症细胞;48h软脑膜充血更显著,蛛网膜下腔扩张更显著,可见炎症细胞浸润;SP+MRP8/14组小鼠与SP组小鼠相比,6h软脑膜明显充血,蛛网膜下腔扩张,可见少数炎症细胞浸润;24h软脑膜极度充血,蛛网膜结构破坏,炎性细胞浸润;48h软脑膜充血更加明显,蛛网膜下腔扩张更显著,可见大量炎症细胞浸润。4、脑组织中NLRP3、NLRC4、IL-1β、Gasdermin D的mRNA的相对表达量的检测:(1)NLRP3 mRNA的相对表达量:MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(0.048±0.020)vs(0.027±0.011)、24h(0.042±0.028)vs(0.041 ±0.013)、48h(0.047±0.024)vs(0.064±0.023),差异均无统计学意义(P>0.05);SP 组小鼠与PBS 组小鼠相比,6h(0.072±0.016)vs(0.027±0.011)、24h(0.082±0.025)vs(0.041±0.013)、48h(0.171 ±0.017)vs(0.064±0.023),差异均无统计学意义(P>0.05);SP+MRP8/14 组小鼠与 SP 组小鼠相比,6h(0.238±0.221)vs(0.072±0.016)、24h(0.309±0.274)vs(0.082±0.025)、48h(0.607±0.233)vs(0.171±0.017),差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)NLRC4 mRNA的相对表达量:MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(0.024±0.004)vs(0.033±0.002)、24h(0.026±0.003)vs(0.028±0.010)、48h(0.026±0.001)vs(0.028±0.002),差异均无统计学意义(P>0.05);SP组小鼠与PBS 组小鼠相比,6h(0.052±0.002)vs(0.033±0.002)、24h(0.075±0.013)vs(0.028±0.010)、48h(0.143±0.036)vs(0.028±0.002),在 24h 和 48h 增加明显,差异有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14组小鼠与SP组小鼠相比,6h(0.116±0.045)vs(0.052±0.002)、24h(0.170±0.014)vs(0.075±0.013)、48h(0.625±0.182)vs(0.143±0.036),差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)IL-1β mRNA的相对表达量:MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(0.055±0.005)vs(0.058±0.008)、24h(0.057±0.021)vs(0.058±0.018)、48h(0.018.±0.001)vs(0.023±0.004),差异均无统计学意义(P>0.05);SP 组小鼠较PBS 组小鼠相比,6h(0.628±0.094)vs(0.058±0.008)、24h(1.360±0.274)vs(0.058±0.018)、48h(2.275±0.140)vs(0.023±0.004),差异均有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14 组小鼠与 SP 组小鼠相比,6h(1.366±0.299)vs(0.628±0.094)、24h(2.198±0.284)vs(1.360±0.274)、48h(5.078±0.488)vs(2.275±0.140),差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)Gasdermin D mRNA的相对表达量:MRP8/14组小鼠与PBS组小鼠相比,6h(0.100±0.005)vs(0.112±0.017)、24h(0.115±0.021)vs(0.106±0.014)、48h(0.102±0.008)vs(0.091±0.010),差异均无统计学意义(P>0.05);SP组小鼠与PBS 组小鼠相比,6h(0.455±0.028)vs(0.112±0.017)、24h(0.780±0.054)vs(0.106±0.014)、48h(1.633±0.164)vs(0.091±0.010),差异均有统计学意义(P<0.05;SP+MRP8/14 组小鼠与 SP 组小鼠相比,6h(0.827±0.039)vs(0.455±0.028)、24h(1.409±0.149)vs(0.780±0.054)、48h(3.285±0.296)vs(1.633±0.164),差异均有统计学意义(P<0.05)。实验结论:1、本实验通过侧脑室途径接种SP混悬液,成功构建了 SPM小鼠模型。2、在SPM小鼠中,脑组织内炎症小体NLRP3/NLRC4及下游促炎性因子IL-1β和成孔蛋白Gasdermin D的mRNA的表达均上调,表明NLRP3/NLRC4信号可能参与了 SPM小鼠脑内的炎症反应过程。3、在SPM小鼠中,MRP8/14的干预,进一步上调了 SPM小鼠脑内炎症小体NLRP3/NLRC4、IL-1β和Gasdermin D的mRNA表达,加剧了 SPM小鼠的临床症状和脑膜炎症浸润,表明炎症小体NLRP3/NLRC4信号可能参与了 MRP8/14对SPM炎症反应的增强作用。