副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)是革拉瑟氏病的致病菌,属于巴斯德菌科家族成员之一,可引发猪多发性浆膜炎和关节炎。常感染早期断奶仔猪,甚至能从健康猪的上呼吸道分离出。Hps常与其它病原菌发生并发或继发感染,死亡率高,致使全世界范围内养猪行业经济损失严重。可以通过抗生素治疗和接种疫苗在一定程度上来预防和控制革拉瑟氏病的发生。然而,防控本病的关键是先对病原体进行鉴别诊断。找到Hps种属特异性基因并以此为靶基因进行PCR扩增,是准确、快速诊断Hps的关键。抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization.SSH)是一项应用于筛选原核生物或真核生物差异基因及差异表达基因的有效途径,应用广泛,近年来可用于比较两种亲缘性相近的菌株基因组之间的差异。本实验以副猪嗜血杆菌(Hps)血清5型参考菌株Nagasaki和与之亲缘性相近的猪胸膜肺炎放线杆菌(App)血清1型参考菌株Shope4074作为研究对象,通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选Hps相对于App的差异基因。分别提取Hps和App基因组DNA,得到完好的核酸条带。经Alu Ⅰ酶37℃酶切消化12h,获得100～2000bp小片段。将充分酶切纯化后的Hps小片段基因均分为两级,分别与两种不同接头进行连接,确保高效连接后,作为检测力Tester,并以App酶切纯化后的产物作为驱动方Driver。冉经过2轮消减杂交和2次抑制性PCR,使相同片段得以云除,差异基因得以富集,经琼脂糖凝胶电泳分析,消减后的样品在100～1000bp范围可见明显的扩增条带,而未消减组呈现与消减组不同的弥散性条带。将第二次PCR扩增后的产物插入pMD19-T载体,热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。从中随机挑选部分克隆,通过试剂盒内巢式PCR引物筛选阳性克隆。Hps和App基因组DNA酶切纯化后产物用地高标记作为探针,差异基因PCR产物分别与两探针进行Southern blot杂交,选择与Hps探针杂交信号强度明显强于与App探针杂交的差异片段进行测序。测序结果去除引物和载体序列后利用BLAST进行同源性比对和分析,共获得7个副猪嗜血杆菌种特异性基因。采用PCR方法检测7个基因片段在Hps15个血清型参考菌株、43株Hps分离菌株及Hps相似菌株中的存在情况,发现VtaA9基因特异性好,在所有Hps菌株中都能得以有效扩增,而且在猪其它病原菌株中均不能得到扩增。通过PCR方法检测Hps Nagasaki参考菌株中VtaA9基因敏感性低至50CFU·mL-1.而且临床疑似样品检测结果可靠。进而,本实验初步建立了以VtaA9基因为靶基因Hps PCR诊断方法。