TP53(编码p53蛋白)是研究得最多的抑癌基因,具有维护基因组稳定性及严密调控细胞生长的功能。p53蛋白作为转录因子通过与特定的DNA序列结合,转录激活下游基因。Mdm2基因是受p53蛋白转录调控的下游基因之一,p53激活Mdm2,后者编码的蛋白通过与p53蛋白的特异性结合,抑制p53的功能。Mdm2蛋白通过其泛素蛋白连接酶的作用,使p53蛋白发生泛素化,并促进其被蛋白酶体降解。Mdm2蛋白正是通过这样一个“自调节负反馈环”对细胞内p53蛋白的合理水平进行精细的调控。p53激活的经典模型如下:携带野生型p53(wt-p53)蛋白的肿瘤细胞遭受DNA损伤后,p53蛋白发生磷酸化,其蛋白质结构发生改变,与Mdm2蛋白的结合被打破,p53的稳定性增加；p53进入细胞核内与特定的DNA序列结合,转录激活下游基因。p53下游基因编码的蛋白中,有导致细胞周期停滞的CDKN1A(p21),有促进调亡发生的Bcl-2蛋白家族成员,如Bax、Puma、Noxa,等等。p53蛋白正是通过转录激活这些基因参与决定细胞的命运。　　 超过50％的人类恶性肿瘤与p53蛋白发生异常有关,其中最常见的异常是p53的DNA结合区发生氨基酸的突变(由TP53基因的点突变造成),使p53蛋白无法与特定的DNA序列结合,无法转录激活下游基因。而在携带wt-p53的恶性肿瘤中,Mdm2基因常发生扩增或产物过表达,使p53蛋白被快速降解而无法在核内达到足够的水平,相比之下,突变的p53(mut-p53)蛋白不激活Mdm2的表达,因而稳定性增加。因此,打破p53-Mdm2的蛋白.蛋白相互作用从而稳定wt-p53蛋白,恢复其抑癌功能,成为了肿瘤小分子靶向治疗开发的新热点。　　 本研究所采用的基于p53-Mdm2多肽一蛋白复合物的晶体结构结合计算机三维药效模型而设计并合成的小分子Mdm2抑制物(MI-219),具有竞争性结合Mdm2蛋白,游离wt-p53并使其蛋白水平上调,能够诱导细胞周期停滞及肿瘤细胞凋亡。　　 乳腺癌在实体瘤中TP53基因突变率较低,而成人急性髓细胞性白血病(acutemyelogenous leukemia,AML)中TP53基因突变率仅约10％,故成为本研究选用的疾病模型。　　 材料与方法：　　 以Mdm2抑制物处理乳腺癌细胞系(MCF-7等)、良性细胞系(HMEC等)、19个AML细胞系以及从109例AML病人外周血或骨髓提纯的分化障碍的白血病细胞(经细胞离心涂片固定染色并经镜下细胞形态学观察确定纯度为90％以上),采用流式细胞仪检测细胞周期停滞以及调亡的发生；采用WST assay检测细胞生长抑制情况；采用Western blotting检测p53,p21,Mdm2,MdmX蛋白的表达；采用针对MdmX的siRNA以及Cisplatin等化疗药物下调MdmX蛋白；采用Q-PCR检测AML临床标本p53,Mdm2,MdmX的mRNA水平；对AML细胞株及提纯后的AML病人白血病细胞的TP53外显子5-9、NPM1基因exon12、以及Flt3-ITD基因突变进行测序；采用SNP6.0 assay以及相关一系列分析软件对病变(白血病细胞DNA)及正常(对应的颊粘膜细胞DNA)染色体17p进行比较；采用DNA甲基转移酶抑制剂(5-azacytadine,5-aza)以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Tricostatin A,TSA)研究表观遗传修饰对p53基因失表达的作用。　　 临床资料的搜集包括每例病人的一般资料、详细的既往病史及治疗史、染色体核型及细胞遗传学分析、病理分期、确诊时外周血及骨髓中白血病细胞的百分比、白血病细胞表面抗原属性等(资料为University of Michigan Hospital所有)。　　 结果：　　 第一部分 MI-219抑制物通过有效上调wt-p53蛋白水平而有效诱导携带wt-p53的乳腺癌细胞发生细胞周期停滞以及细胞凋亡,但对正常细胞无毒性。　　 携带wt-p53蛋白的乳腺癌细胞在MI-219处理后发生细胞生长抑制、G1期细胞周期停滞、以及细胞凋亡,而携带mut-p53蛋白的乳腺癌细胞对MI-219没有反应。M1-219能够上调wt-p53的蛋白水平,而不改变mut-p53的蛋白水平。携带wt-p53的MCF-7/Her-2(稳定表达Her-2)细胞与其对照MCF-7/vec(空白质粒)对MI-219处理的反应没有显著差异。用siRNA下调MdmX蛋白的水平,或用化疗药物处理乳腺癌细胞以达到下调MdmX蛋白的目的,这两种手段均对MI-219诱导的调亡起协同作用。MI-219能够诱导良性细胞发生细胞周期停滞,但不发生细胞凋亡。　　 第二部分多种分子机制共同决定成人急性髓细胞性白血病对Mdm2抑制物的敏感或者抗药。　　 在携带wt-p53的AML病人当中,有大约30％病人对Mdm2抑制物发生抗药。17号染色体短臂(17p)的中性杂和性缺失在AML病人中很常见,大多数合并TP53基因突变或不表达。TP53基因突变不能涵盖该AML群体中所有对Mdm2抑制物抗药的病例。至少在本研究当中,wt-p53携带者中,p53蛋白低表达或失表达不能被DNA甲基转移酶抑制剂或组蛋白去乙酰化酶抑制剂逆转。样本中Mdm2或MdmX蛋白的基础表达水平与样本对Mdm2抑制物的IC50没有关联。在本研究当中,完整功能的wt-p53以及Flt3-ITD同时存在的病例对Mdm2抑制物尤为敏感。　　 结论：　　 第一部分:　　 1.与正常细胞相比,乳腺癌细胞高表达Mdm2蛋白。　　 2.Mdm2抑制物有效诱导携带wt-p53的乳腺癌细胞发生凋亡,但对正常细胞无毒性,将很有可能成为针对携带wt-p53蛋白的恶性肿瘤的新型靶向治疗药物。　　 3.Mdm2抑制物能够有效诱导高表达Her2/neu的乳腺癌细胞发生细胞凋亡。　　 4.下调MdmX蛋白对Mdm2抑制物所诱导的细胞凋亡起协同作用。　　 5.Mdm2抑制物与传统化疗药物联合应用能够协同杀死携带wt-p53的乳腺癌细胞。　　 第二部分:　　 1.对TP53突变的病人不应给予Mdm2抑制物。　　 2.不能一味地认为wt-p53的病例100％对Mdm2抑制物敏感　　 3.联合应用多种基因异常检测手段检测以TP53基因异常为主的遗传标记物才能最大程度区分出有可能对Mdm2抑制物抵抗的病例。　　 4.Flt3-ITD突变存在下的绝大部分AML对Mdm2抑制物极其敏感,但目前尚缺乏具备敏感性和特异性的检测方法以有效地识别对Mdm2抑制物抵抗的病例。　　 5.目前临床实践中尚缺乏具备敏感性和特异性的检测方法以有效地识别对Mdm2抑制物抵抗的病例　　 因此,提取病人外周血或骨髓中的AML细胞以测定其对Mdm2抑制物的敏感性能够对Mdm2抑制物在临床治疗AML中选择敏感病例及制定治疗方案提供指导。