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第一部分:橙皮素对体外脂多糖诱导的炎症因子变化的影响
目的:研究橙皮素(hesperetin，HES)对体外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症因子变化的影响。
方法:体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)及人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)，将两种细胞均分为空白对照组(CON组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+橙皮素(10μM与40μM)预处理组(LPS+HES(10μM)组和LPS+HES(40μM)组)。其中，LPS+HES(10μM)组及LPS+HES(40μM)组分别用终浓度为10μM和40μM的HES预处理RAW264.7和BEAS-2B细胞2小时后，再加入LPS刺激24小时，通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法，测定不同浓度下HES对LPS诱导的炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)与白介素-6(interlukin-6，IL-6)蛋白表达水平的改变情况;同样，LPS+HES(10μM)组及LPS+HES(40μM)组分别用终浓度为10μM和40μM的HES预处理RAW264.7和BEAS-2B细胞2小时后，再加入LPS刺激6小时，用实时荧光定量反转录酶-聚合酶链锁反应(Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测不同浓度下HES对LPS诱导体外炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平改变情况。
结果:在RAW264.7与BEAS-2B两种细胞中，与CON组相比，LPS组强烈诱导TNF-α和IL-6的mRNA表达水平(P＜0.01)与蛋白水平(P＜0.01)，利用10μM或40μM-HES预处理后可显著抑制两种炎症因子的mRNA表达(P＜0.01)与蛋白水平(P＜0.01)，但相比10μM，40μM的HES预处理后会具有更良好的抗炎作用。
结论:HES可以抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6表达水平，并且其抑制活性具有良好的剂量依赖关系。
第二部分:橙皮素对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤保护作用
目的:研究橙皮素(HES)对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的保护作用。
方法:选C57BL/6雄鼠28只，体重22±2克，随机分为空白对照组(CON组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+橙皮素(25 mg/kg)预处理组(LPS+HES(25mg/kg)组)及脂多糖+橙皮素(50 mg/kg)预处理组(LPS+HES(50mg/kg)组)，每组7只。LPS+HES(25 mg/kg)组及LPS+HES(50 mg/kg)组用浓度分别为25mg/kg和50mg/kg的HES提前一周每天灌胃小鼠。造模6h后，收集血清、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)与肺组织。通过HE染色观察肺组织病理学变化;采用Bradford蛋白检测试剂盒检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度;用标准血细胞计数器测定支气管BALF中的总细胞计数;用髓过氧化物酶检测试剂盒测定均同质化的肺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性;采用ELISA法测定BALF和血清中TNF-α，IL-6的表达水平，并用RT-qPCR分析肺组织中TNF-α，IL-6的mRNA表达水平。
结果:与CON组小鼠相比，LPS组小鼠肺间质和肺泡间隙被大量炎性细胞浸润、肺泡完整性被破坏、肺泡壁增厚以及肺泡腔充血，同时，用25mg/kg及50mg/kg的HES预处理后，LPS诱导的肺组织病理损伤均显著减弱(P＜0.01)、小鼠肺水肿情况也明显缓解(P＜0.01);急性肺损伤小鼠中LPS会造成细胞损伤，引起BALF中总蛋白浓度升高、中性粒细胞数增加，而HES有助于降低BALF中的总蛋白浓度、降低中性粒细胞数量(P＜0.05)，从而有助于保护肺组织并且发挥抗炎作用;此外，HES剂量依赖的降低了由LPS造成的肺组织高水平MPO(P＜0.05);同时，HES也可以明显缓解LPS诱导肺组织、血清与BALF中炎症因子TNF-α、IL-6过量表达，并且，高剂量HES(50 mg/kg)预处理效果显著优于低剂量预处理HES(25 mg/kg)((P＜0.05)。
结论:HES通过减轻肺水肿程度、降低MPO表达、降低BALF中总蛋白浓度、总细胞数与中性粒细胞数，抑制促炎因子释放等，对LPS诱导的小鼠急性肺损伤发挥保护作用。
第三部分:橙皮素对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的保护机制
目的:研究橙皮素(HES)是否通过与髓样分化蛋白2(Myeloid differentiation，MD2)结合，抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和NF-κB信号通路激活，从而抑制脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)而发挥保护作用。
方法:通过LeDock分子对接软件预测探索HES和MD2之间的结合模式，通过蛋白质印迹法检测MAPK和NF-κB信号通路的相关蛋白的表达，并通过免疫共沉淀技术检测HES是否能抑制MD2和Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)复合。
结果:LeDock分子对接软件显示HES与MD2上的LPS结合位点重叠，免疫共沉淀实验证明HES可以阻断LPS诱导的MD2与TLR4复合。同时，LPS诱导MAPKs通路p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-P38/P38激活(P＜0.05)，促进IκB降解，而HES可以显著抑制MAPKs的磷酸化、阻断IκB降解过程(P＜0.01)，并且50mg/kg-HES抑制活性大于25mg-HES。
结论:HES能直接与MD2结合，阻断LPS诱导的MD2和TLR4结合，从而抑制MAPKs的激活与保护IκB不被降解，最终发挥对LPS诱导ALI小鼠的保护作用。
目的:研究橙皮素(hesperetin，HES)对体外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症因子变化的影响。
方法:体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)及人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)，将两种细胞均分为空白对照组(CON组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+橙皮素(10μM与40μM)预处理组(LPS+HES(10μM)组和LPS+HES(40μM)组)。其中，LPS+HES(10μM)组及LPS+HES(40μM)组分别用终浓度为10μM和40μM的HES预处理RAW264.7和BEAS-2B细胞2小时后，再加入LPS刺激24小时，通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法，测定不同浓度下HES对LPS诱导的炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)与白介素-6(interlukin-6，IL-6)蛋白表达水平的改变情况;同样，LPS+HES(10μM)组及LPS+HES(40μM)组分别用终浓度为10μM和40μM的HES预处理RAW264.7和BEAS-2B细胞2小时后，再加入LPS刺激6小时，用实时荧光定量反转录酶-聚合酶链锁反应(Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测不同浓度下HES对LPS诱导体外炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平改变情况。
结果:在RAW264.7与BEAS-2B两种细胞中，与CON组相比，LPS组强烈诱导TNF-α和IL-6的mRNA表达水平(P＜0.01)与蛋白水平(P＜0.01)，利用10μM或40μM-HES预处理后可显著抑制两种炎症因子的mRNA表达(P＜0.01)与蛋白水平(P＜0.01)，但相比10μM，40μM的HES预处理后会具有更良好的抗炎作用。
结论:HES可以抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6表达水平，并且其抑制活性具有良好的剂量依赖关系。
第二部分:橙皮素对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤保护作用
目的:研究橙皮素(HES)对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的保护作用。
方法:选C57BL/6雄鼠28只，体重22±2克，随机分为空白对照组(CON组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+橙皮素(25 mg/kg)预处理组(LPS+HES(25mg/kg)组)及脂多糖+橙皮素(50 mg/kg)预处理组(LPS+HES(50mg/kg)组)，每组7只。LPS+HES(25 mg/kg)组及LPS+HES(50 mg/kg)组用浓度分别为25mg/kg和50mg/kg的HES提前一周每天灌胃小鼠。造模6h后，收集血清、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)与肺组织。通过HE染色观察肺组织病理学变化;采用Bradford蛋白检测试剂盒检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度;用标准血细胞计数器测定支气管BALF中的总细胞计数;用髓过氧化物酶检测试剂盒测定均同质化的肺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性;采用ELISA法测定BALF和血清中TNF-α，IL-6的表达水平，并用RT-qPCR分析肺组织中TNF-α，IL-6的mRNA表达水平。
结果:与CON组小鼠相比，LPS组小鼠肺间质和肺泡间隙被大量炎性细胞浸润、肺泡完整性被破坏、肺泡壁增厚以及肺泡腔充血，同时，用25mg/kg及50mg/kg的HES预处理后，LPS诱导的肺组织病理损伤均显著减弱(P＜0.01)、小鼠肺水肿情况也明显缓解(P＜0.01);急性肺损伤小鼠中LPS会造成细胞损伤，引起BALF中总蛋白浓度升高、中性粒细胞数增加，而HES有助于降低BALF中的总蛋白浓度、降低中性粒细胞数量(P＜0.05)，从而有助于保护肺组织并且发挥抗炎作用;此外，HES剂量依赖的降低了由LPS造成的肺组织高水平MPO(P＜0.05);同时，HES也可以明显缓解LPS诱导肺组织、血清与BALF中炎症因子TNF-α、IL-6过量表达，并且，高剂量HES(50 mg/kg)预处理效果显著优于低剂量预处理HES(25 mg/kg)((P＜0.05)。
结论:HES通过减轻肺水肿程度、降低MPO表达、降低BALF中总蛋白浓度、总细胞数与中性粒细胞数，抑制促炎因子释放等，对LPS诱导的小鼠急性肺损伤发挥保护作用。
第三部分:橙皮素对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的保护机制
目的:研究橙皮素(HES)是否通过与髓样分化蛋白2(Myeloid differentiation，MD2)结合，抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和NF-κB信号通路激活，从而抑制脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)而发挥保护作用。
方法:通过LeDock分子对接软件预测探索HES和MD2之间的结合模式，通过蛋白质印迹法检测MAPK和NF-κB信号通路的相关蛋白的表达，并通过免疫共沉淀技术检测HES是否能抑制MD2和Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)复合。
结果:LeDock分子对接软件显示HES与MD2上的LPS结合位点重叠，免疫共沉淀实验证明HES可以阻断LPS诱导的MD2与TLR4复合。同时，LPS诱导MAPKs通路p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-P38/P38激活(P＜0.05)，促进IκB降解，而HES可以显著抑制MAPKs的磷酸化、阻断IκB降解过程(P＜0.01)，并且50mg/kg-HES抑制活性大于25mg-HES。
结论:HES能直接与MD2结合，阻断LPS诱导的MD2和TLR4结合，从而抑制MAPKs的激活与保护IκB不被降解，最终发挥对LPS诱导ALI小鼠的保护作用。