龙眼(Dimocarpus longanLour.)是我国重要的热带和亚热带木本特产果树,具有重要的经济价值。龙眼生产上存在许多问题制约其产业发展,如焦核品种的缺乏、成熟期过于集中等。龙眼胚胎发育的研究对解决这些问题具有重要意义。研究指出DNA甲基化和胚胎(体胚)的发生息息相关。一定程度的DNA甲基化水平有利于植物体胚的正常发育,而结构域重排甲基化酶DRM(Domain rearrangement methylation)是甲基酶中的一种,是lmiRNA介导甲基化通路中的关键因子。鉴于此,本研究拟借助龙眼体胚发生系统,以龙眼胚性愈伤组织的转录组数据为基础,进行龙眼胚性愈伤组织DlDRMs基因克隆和生物学信息分析,亚细胞定位分析,启动子克隆与顺式作用元件分析;同时,利用qPCR技术,检测DlDRMs在’四季蜜’龙眼不同组织部位、体胚发育不同阶段、不同激素和不同非生物胁迫处理下的表达情况;利用寡核苷酸沉默技术和显微技术,特异性抑制龙眼体胚内源DlDRMs家族基因表达,并观察该处理对体胚发生早期的影响,以期为揭示DlDRMs家族基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定基础。研究结果如下:1龙眼DlDRMs克隆与生物信息学分析龙眼转录组数据库(GenBank登录号:SRA059205)分析和GeneBank比对,发现龙眼胚性愈伤组织中DRM蛋白有2种,为DRM1和DRM2,且都包含完整的ORF。在此基础上,以龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板,利用RT-PCR技术对DRM1和DRM2进行克隆验证,克隆序列与转录组序列一致。DRM1基因包括494bp的5’UTR,184bp的3’UTR,包含完整的ORF,ORF区长度为1896bp,编码631个氨基酸,命名为DlDRM1(登录号:KY990493)。DRA2基因包括 354bp 的 5’UTR,336bp 的3’UTR,包含完整的ORF,ORF区长度为2112bp,编码703个氨基酸,命名为DlDRM2(登录号:MF001059)。生物信息学分析表明:DlDRM1和DlDRM2的基本理化性质相似,且都属于不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,不存在跨膜结构域,有Dcm保守结构域,在进化树中与脐橙的亲缘关系最近。可见,不同成员之间可能具有相似的功能。DlDRM1蛋白定位于细胞核和细胞膜上,DlDRM2蛋白定位于细胞核上。两者之间的磷酸化位点、卷曲螺旋结构、蛋白质二三级结构等的具体参数存在一定差异,推测其可能存在功能特异性。2龙眼D1DRMs亚细胞定位分析在DlDRM 和DlDRM2 ORF序列基础上,构建 1302-DlDRM1-GFP和1302-DlDRM2-GFP表达载体,采用农杆菌介导法侵染洋葱表皮细胞,利用荧光共聚焦显微镜观察洋葱表皮中的荧光。结果表明,DlDRM1蛋白定位于细胞核和细胞膜上,DlDRM2蛋白定位于细胞核,与软件预测一致。细胞核是DNA复制的主要场所,对细胞周期具有重要的功能,DRM蛋白的亚细胞定位研究,为进一步探究该基因的功能奠定基础。3龙眼DlDRMs启动子克隆与分析在龙眼基因组数据库中分别提取的DlDRM1和DlDRM2基因的5’端序列(起始密码子ATG上游序列),采用PCR法,以龙眼胚性愈伤组织DNA为模板进行克隆,获得2条大小分别为2594bp和2354bp的5’端序列,与基因组序列一致。运用DNAMAN比对,发现DlDRM1和DlDRM2序列同源性较低,且它们的identity为35.58%,说明它们的进化水平可能存在差异。为进一步了解龙眼DlDRMs基因的功能,运用PlantCARE在线软件对DlDRMs基因5’侧翼序列的启动子元件进行预测,结果表明,DlDRMs基因启动子中含有丰富的光响应元件、激素响应元件、逆境及植物生长发育相关的作用元件。可见,DlDRMs基因的表达调控可能受多种激素和非生物胁迫的影响。4龙眼DlDRMs在不同组织部位、体胚不同发育阶段、外源激素和不同胁迫处理下的qPCR分析DlDRMs基因在龙眼不同组织部位中都有表达且表达趋势基本一致,即在果肉中表达量最高,其次花蕾,在叶中表达量最低。在同一组织部位中,DlDRM1基因的表达量均高于DlDRM2基因。猜测DlDRMs参与了龙眼组织器官的分化和形成,并且龙眼不同组织部位DNA甲基化水平存在差异。DlDRM1和DlDRM2基因在龙眼体胚发育过程中的表达趋势不一致。其中,DlDRM1在龙眼愈伤非胚性和胚性培养过程中均有表达,总体呈现出下降趋势,其中在非胚性愈伤组织中表达量最高,子叶胚阶段中表达量最低。DlDRM2基因在龙眼体胚发生过程中的转录水平,近似倒“V”模式,在ICpEC处达到相对表达量的最大值,由此可以推断出,龙眼愈伤非胚性与胚性的转化可能与DlDRM1基因的表达有关,而DlDRM2在不完全胚性紧实结构中的调控作用最为显著。以龙眼胚性愈伤组织为材料进行2,4-D、KT、SA、5-azac、GA3、ABA激素处理,发现DlDRM和和DlDRM2的表达量有相似性,但也存在一定差异。在一定浓度范围内,外源激素2,4-D、SA和5azac能促进DlDRM1表达,而KT、GA3和ABA对DlDRM1表达起到抑制作用;外源激素2,4-D、KT和SA均能提高DlDRM2表达,而5-azac、GA3和ABA却明显抑制DlDRM2表达。在蔗糖、温度、盐、光质的非生物胁迫处理下,DlDRM1和DlDlRM2在相同条件下的表达趋势基本一致,可能功能相似。而在不同光照下,DlDRM2受光影响比较大,单一光照下表达量均有所下降,DlDRM1的表达几乎不受光变化的影响。试验结果进一步证实,DlDRMs基因的表达调控在龙眼生长发育和胁迫响应中发挥重要功能。5龙眼DlDRMs基因沉默对体胚发生早期的影响根据DlDRMs基因ORF序列设计并合成敲除DlDRMs基因的siRNA,随后处理龙眼胚性愈伤,qPCR检测分析结果显示,DlDRM1-siRNA-314和DlDRM2-siRNA-1599抑制效果最好。用筛选出的siRNA进行后续的龙眼体胚转化试验,结果表明,单独抑制DlDRM1时,DlDRM1基因的表达趋势下调,而DlDRM2基因的表达却呈现出明显上调趋势,龙眼体胚分化速度并无明显变化;单独抑制DlDRM2时,DlDRM2基因的表达趋势下调,DlDRM1基因的表达趋势也下调,但下调趋势没有单独抑制DlDRM1时明显,龙眼体胚分化速度略微加快;同时抑制DlDRM1和DlDRM2时,两者的表达趋势均出现下调,DlDRM1下调趋势较单独抑制DlDRM1时更显著,而DlDRM2下调趋势和单独抑制DlDRM2时下调程度一样,龙眼体胚分化速度明显加快。推测,在体胚发生过程中,DlDRM2对DlDRM1的表达有一定的调控作用,且在DlDRMs家族中,DlDRM2可以替代DlDRM1发挥部分功能,而DlDRM1对DlDRM2的表达几乎没影响。