目的:　　作为表观遗传的另一层面，真核生物mRNA上甲基化m6A修饰日益受到关注。NOL1/NOL2/Sun domain family，member5(NSUN5)是m6A的识别蛋白之一，我们应用CRISPR/Cas9技术建立NSUN5基因敲除小鼠模型，为进一步研究mRNA上m6A修饰的生物学功能打下基础。　　方法:　　1.2U6-sgRNA表达载体构建及效率检测:针对NSUN5基因第三外显子，设计一对sgRNAs，合成2U6-sgRNA寡核苷酸链，采用PCR的方法扩增出必要元件，克隆至pGL3真核表达载体中;在小鼠DC2细胞上检测sgRNA切割效率。　　2.T7-sgRNA表达载体构建:将设计好的一对sgRNAs分别合成T7-sgRNA寡核苷酸链，经退火、连接和转化后，克隆进pUC57-sgRNA表达载体中。　　3.体外转录:　　体外转录Cas9和Cas9-D10A质粒:用Age1线性化pST1374-Cas9和pST1374-Cas9-D10A质粒，应用T7 Ultra试剂盒进行体外转录实验，转录后的Cas9mRNA和Cas9-D10AmRNA应用RNeasy Mini试剂盒纯化，分装转录产物冻于-80℃保存。　　体外转录sgRNA质粒:采用PCR方法扩增出pUC57-sgRNA表达载体上的T7启动子和sgRNA序列作为转录模板，应用MEGAshortscript试剂盒进行体外转录，转录产物用MEGAclear试剂盒纯化，分装转录产物冻于-80℃保存。　　4.T7核酸内切酶Ⅰ检测基因编辑效率:应用CRISPR/Cas9进行基因编辑时，能够使打靶位点处DNA双链断裂，机体通过NHEJ可修复DSB，在此过程中会随机引入突变。由于基因编辑效率不可能达到100％，并且突变具有随机性，所以在sgRNA打靶位点处存在多种基因型。采用PCR方法将打靶位点上下游基因扩增出来，产生各种不同基因突变的PCR片段，纯化PCR产物后经过退火，各种不完美互补配对的单链产物随机组合到一起，形成发夹样或泡状结构。T7核酸内切酶Ⅰ能够识别这种结构并将该处双链DNA切断，通过凝胶电泳可判断Cas9/sgRNA切割效率。　　5.NSUN5蛋白敲除与否鉴定:提取NSUN5纯合子基因型和野生型小鼠各组织器官蛋白和RNA，通过免疫印迹和实时荧光定量PCR的方法，结合对NSUN5的cDNA序列进行分析，综合评价NSUN5蛋白表达情况。　　6.脱靶效应检测:根据sgRNAs+PAM(23bp)作用靶点序列，结合对小鼠全基因组序列进行分析，找到所有潜在的脱靶位点。在允许与sgRNA序列4个以下碱基错配的前提下，对每个sgRNA各选取的10个容易发生脱靶效应的位点、采用T7EN1实验进行检测，对检测到突变的PCR产物进行T-A克隆测序加以确认。　　7.NSUN5-/-小鼠生殖系统表型分析:取成年（12周）雄性NSUN5-/-小鼠和野生型对照组睾丸和附睾组织进行石蜡包埋、切片和HE染色，采用HE染色技术检测生殖细胞的形态学变化。　　结果:　　1.成功构建2U6-sgRNA和T7-sgRNA表达载体:将合成的sgRNAs寡核苷酸链分别克隆进pGL3-sgRNA和pUC57-sgRNA质粒中，经测序后结果正确，说明成功构建了2U6-sgRNA和T7-sgRNA表达载体。　　2.2U6-sgRNA在DC2细胞上能够高效进行基因编辑:分别将Cas9+2 U6-sgRNA和Cas9-D10A+2U6-sgRNA转染DC2细胞72h后，裂解细胞并提取基因组，采用T7EN1实验检测基因编辑效率，结果显示Cas9+2U6-sgRNA和Cas9-D10A+2U6-sgRNA均能够对小鼠DC2细胞基因组产生较强的切割条带，T-A克隆测序结果显示切割效率分别为40％和50％。　　3.体外转录:体外转录Cas9、Cas9-D10A和sgRNAs表达载体，转录产物经纯化后进行凝胶电泳，以确认其完整性。结果显示Cas9 mRNA、Cas9-D10AmRNA和sgRNA条带单一，表明无降解现象，其条带大小与预期结果一致。以上说明我们成功转录出Cas9 mRNA、Cas9-D10A mRNA和sgRNA。　　4.NSUN5基因敲除小鼠获取:对小鼠一细胞期受精卵显微注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9-D10A mRNA/sgRNA，后来我们得到由Cas9/sgRNAs作用出生的小鼠17只;由Cas9-D10A/sgRNAs作用出生的小鼠7只，对PCR凝胶电泳即表现出突变的个体进行T-A克隆，测序后发现Cas9/sgRNAs作用后的小鼠突变范围在(-100～+13bp)，Cas9-D10A/sgRNAs作用后的小鼠突变范围在(-82～-21bp)。　　5.小鼠NSUN5蛋白表达分析:免疫印迹结果显示在敲除小鼠上，与NSUN5蛋白大小相似的位置出现条带;RT-PCR结果显示在RNA水平上，其NSUN5转录后mRNA序列确实是缺失了44nt;对基因修饰后NSUN5的cDNA序列分析显示，起始密码ATG到缺失序列之间为267bp，紧接着缺失序列下游便出现了终止密码TGA，所以NSUN5基因缺失了44bp后仅能翻译出89个氨基酸的无功能蛋白。免疫印迹结果显示在与NSUN5蛋白大小相似的位置出现条带，是因为使用的抗体为多克隆抗体，特异性很差，相似大小且同源性很高的蛋白被检测到，实为假阳性结果。综上所述，小鼠的NSUN5蛋白理论上是被彻底敲除的。　　6.对比Cas9/sgRNAs和Cas9-D10A/sgRNAs在F0代敲除小鼠产生的脱靶效应:根据sgRNAs+PAM作用靶点序列，对F0代敲除小鼠潜在脱靶位点采用T7核酸内切酶Ⅰ方式检测突变。结果显示在选取的6只F0代敲除小鼠上，两个sgRNAs潜在的20个脱靶位点均未检测到突变。　　7.NSUN5敲除后对小鼠生殖系统影响分析:对NSUN5纯合子基因型和野生型小鼠睾丸和附睾组织进行形态学分析，结果显示睾丸和附睾组织在形态上并无异常差异，HE染色结果也不存在变化;将纯合子基因型小鼠交配，发现小鼠能够正常怀孕并且生出小崽，基因均为纯合子型。　　结论:　　通过本项目的研究，应用Cas9/sgRNAs和Cas9-D10A/sgRNAs成功敲除与mRNA甲基化功能密切相关的基因(NSUN5)，构建了NSUN5基因敲除小鼠模型，对F0代突变小鼠进行脱靶位点分析，未检测到脱靶位点的存在。该模型的成功构建为进一步研究NSUN5基因与mRNA甲基化之间的关系奠定基础。