【目的】miR-146b-5p不同程度的表达于人体各种组织,且在肺、胸腺和脾中特异性高表达。最初发现miR-146b-5p是一种重要的炎症调节因子,并在先天性免疫过程中发挥重要作用。已有研究发现,在恶性黑色素瘤、乳腺癌和胰腺癌中均有miR-146b-5p表达异常减少,并证实miR-146b-5p是上述恶性肿瘤的重要抑瘤miRNA。编码miR-146b-5p的基因定位于人类染色体10q24-26区段,我们之前的研究已经证实10q24-26是胶质瘤基因组DNA丢失的热点区段,该区段的丢失导致胶质瘤细胞中miR-146b-5p表达异常减少;而提高细胞内miR-146b-5p的水平可以通过靶向敲低MMP-16表达、抑制细胞外液中MMP2酶原的激活有效抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。然而,miR-146b-5p对胶质瘤细胞增殖凋亡有何影响,其调控增殖凋亡的靶点及分子机制如何尚需研究探讨;胶质瘤组织中miR-146b-5p表达水平与肿瘤良恶性级别、肿瘤细胞生物学行为特征及患者预后有何关系尚需进一步证实。本室此前研究已经证实SND1在胶质瘤组织中异常高表达,且其表达水平是患者预后的风险因子,但SND1在胶质瘤细胞表达异常升高的原因尚不清楚。生物信息学分析预测SND1基因是miR-361-5p的靶基因,且已有研究显示miR-361-5p在多种颅外恶性肿瘤中表达异常降低,所致靶基因表达异常对促进肿瘤发生发展及维持其恶性生物学行为均有重要的意义。特别在胃癌和结肠癌中,miR-361-5p能通过靶向敲低SND1的表达影响肿瘤细胞的增殖和迁移能力。但在胶质瘤细胞中miR-361-5p表达情况如何,SND1基因是否仍是其靶基因,其它重要的靶基因还有哪些,miR-361-5p通过特异性敲低这些靶基因的表达能发挥何肿胶质瘤抑瘤作用,这些抑瘤作用的分子机制如何均尚待进一步研究。本研究采用人胶质瘤组织标本及人胶质母细胞瘤细胞系对上述问题进行了深入探讨,以期进一步了解胶质瘤发生、发展的分子机制,为胶质瘤分子病理学诊断和患者预后评估筛选可靠的分子标志物,为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗筛选抑瘤因子和干预靶点,并为建立相应的干预策略提供客观的理论依据。【方法】1.采用锁核酸探针原位杂交技术（ISH）检测WHO I～IV级共147例胶质瘤组织和20例非肿瘤对照脑组织中miR-146b-5p的表达水平;采用免疫组织化学方法（IHC）检测上述组织标本中TRAF6及Ki-67抗原的表达水平;结合TCGA数据库数据,分析miR-146b-5p与TRAF6表达水平之间的关系;结合临床随访资料,分析miR-146b-5p及TRAF6的表达水平与肿瘤良恶性级别及患者总生存期（OS）和无症状生存期（DFS）之间的关系,明确其在胶质瘤辅助病理诊断和患者预后评估中的意义。2.分别采用茎环q RT-PCR和Western blot检测和比较8种常见胶质母细胞瘤（GBM）细胞系及非肿瘤永生化星形胶质细胞系（UC2）miR-361-5p及SND1的表达水平,分析二者之间的相关性。3.利用生物信息学软件预测miR-146b-5p及miR-361-5p的靶基因并通过荧光素酶实验验证预测结果。利用miR-146b-5p和miR-361-5p mimics转染GBM细胞系,观察miR-146b-5p对TRAF6以及miR-361-5p对SND1和Fox M1 m RNA和蛋白含量的影响,以证实上述miRNA对靶基因表达的调节作用和机制。4.采用CCK-8实验、Ki-67 Western blot、克隆形成实验以及Ed U细胞增殖实验等方法检测miR-146b-5p和miR-361-5p mimics转染对GBM细胞增殖的影响;采用碱性单细胞电泳实验（SCGE）及流式细胞术（FCM）检测上述mimics转染对GBM细胞凋亡的影响;采用划痕实验和transwell体外迁移侵袭实验检测转染对GBM细胞迁移侵袭的影响。通过上述实验明确miR-146b-5p和miR-361-5p的胶质瘤抑瘤作用。5.观察TRAF6特异性小干扰RNA（si RNA）能否模拟miR-146b-5p对GBM细胞增殖和凋亡的调控效应。利用Western blot检测miR-146b-5p mimics和TRAF6 si RNA转染对NFκB通路关键控节因子TAK1和IκBα表达及磷酸化水平的影响,探索miR-146b-5p调节GBM细胞增殖、凋亡的分子通路以及特异性敲低TRAF6表达在其中发挥的作用。6.观察miR-361-5p mimics转染对GBM细胞MMP2及β-catenin表达的影响及其与转染细胞迁移侵袭和增殖凋亡的关系。通过生物信息学分析预测MMP2基因及CTNNB1基因启动子区SND1和Fox M1结合位点,采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）技术观察SND1和Fox M1是否可能与上述位点特异性结合,以探索其上调MMP2及β-catenin表达的机制。通过SND1和Fox M1真核表达质粒转染观察补充外源性SND1和Fox M1能否逆转miR-361-5p对GBM细胞MMP2和β-catenin表达以及迁移侵袭和增殖凋亡的影响,探索该miRNA抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭并诱导其凋亡的分子通路。【结果】1.ISH结果显示,各级别胶质瘤组miR-146b-5p阳性标记指数（LI%）均明显低于非肿瘤对照脑组织,且均随肿瘤的良恶性级别的升高而降低,各组间差异均有统计学意义;IHC结果显示,各级别胶质瘤组TRAF6及Ki-67阳性标记指数（LI%）均明显高于非肿瘤对照脑组织,并均随肿瘤的良恶性级别的升高而升高,各组间差异均有统计学意义;相关分析显示,miR-146b-5p LI%与TRAF6、Ki-67 LI%均呈显著性负相关,这与TCGA数据分析结果相同;Kaplan-Meier生存分析证实,miR-146b-5p高表达患者的DFS和OS均高于低表达患者,而TRAF6高表达患者的无病生存时间和总生存时间均低于TRAF6低表达患者;Cox回归分析显示,miR-146b-5p与TRAF6分别为影响患者生存时间的保护因素和风险因素,其中miR-146b-6p LI%为患者DFS和OS的独立预测因子。2.八种GBM细胞系miR-361-5p表达水平均明显低于UC2,而SND1表达水平则明显高于后者。各细胞系miR-361-5p及SND1表达水平呈显著性负相关。3.生物信息学分析及荧光素酶实验均证实在胶质瘤细胞中,TRAF6基因是miR-146b-5p的靶基因,而SND1基因和Fox M1基因均是miR-361-5p的靶基因。q RT-PCR及Western blot检测结果显示miR-146b-5p mimics转染可降低GBM细胞系TRAF6 m RNA和蛋白的水平,而miR-361-5p可降低SND1和Fox M1的水平,证实上述miRNA可通过诱导m RNA降解和（或）抑制其翻译过程在转录后抑制靶基因编码蛋白的表达。4.CCK-8及Ki-67 Western blot检测结果显示miR-146b-5p可明显抑制GBM细胞增殖,SCGE及FCM结果则显示该miRNA可有效诱导GBM细胞凋亡,且TRAF6 si RNA可完全模拟miR-146b-5p的上述胶质瘤抑瘤效应。此外,miR-146b-5p或TRAF6 si RNA并不影响GBM细胞TAK1及IκBα的表达水平,但可有效抑制其磷酸化,增强其对NFκB信号传导通路活性的抑制。以上结果证实miR-146b-5p可通过特异性敲低TRAF6抑制NFκB通路的活性从而发挥抑制GBM细胞增殖和诱导其凋亡的作用。5.划痕实验及Transwell体外迁移侵袭实验结果显示miR-361-5p可有效抑制GBM细胞MMP2表达和迁移侵袭能力,而补充外源性SND1可部分逆转上述抑制效应。Ch IP实验结果显示,SND1可直接结合于MMP2基因并通过转录共激活方式诱导MMP2 m RNA的转录和蛋白的表达。以上结果证实在GBM细胞中SND1是MMP2表达的正性调节因子,miR-361-5p可通过敲低SND1的表达抑制其对MMP2表达的诱导并藉此抑制GBM细胞的迁移和侵袭。6.CCK-8、平板克隆实验及Ed U细胞增殖实验检测结果显示,miR-361-5p可有效抑制GBM细胞的增殖并诱导其凋亡,且上述效应可被补充外源性Fox M1部分逆转。Ch IP实验结果显示Fox M1可特异性结合于CTNNB1基因的启动子区并激活该基因的转录从而诱导β-catenin的表达。以上结果证实在GBM细胞中Fox M1是β-catenin表达的正性调节因子,miR-361-5p可通过敲低Fox M1的表达抑制其对β-catenin表达的诱导并藉此抑制GBM细胞的增殖,诱导其凋亡。【结论】1.人胶质瘤组织的肿瘤细胞中普遍有miR-146b-5p及miR-361-5p表达的异常减少和TRAF6、SND1及Fox M1表达的异常增加;miR-146b-5p与TRAF6的表达水平均与胶质瘤良恶性级别和患者预后密切相关,可作为辅助胶质瘤良恶性分级和评价患者预后的重要参考指标,且miR-146b-5p LI%是胶质瘤患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。2.在胶质瘤细胞中,miR-146b-5p是TRAF6表达的重要负调节因子,miR-361-5p是SND1和Fox M1表达的重要负调节因子,二种miRNA表达异常减少是胶质瘤细胞中TRAF6、SND1和Fox M1异常过表达的重要原因,在胶质瘤发生发展和增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为调控中发挥重要作用。3.在胶质瘤细胞中,TRAF6和Fox M1分别是NFκB通路和Wnt/β-catenin通路信号传导功能的重要调控因子。TRAF6可通过诱导TAK1和IκBα的磷酸化促进p65:p50活性复合物的释放,激活NFκB通路;而Fox M1则是CTNNB1基因的转录激活因子,能通过与该基因启动子区特异性位点结合直接上调β-catenin表达,激活Wnt/β-catenin通路。上述两通路的异常活化均可导致胶质瘤细胞的过度增殖和凋亡抑制。miR-146b-5p和miR-361-5p表达异常降低所致TRAF6和β-catenin过表达是胶质瘤细胞获得无限增殖能力和逃避衰老凋亡的重要分子机制。提高胶质瘤细胞中miR-146b-5p和miR-361-5p含量则可通过敲低TRAF6和β-catenin的表达抑制上述通路的过度激活,从而发挥抑制胶质瘤增殖和诱导其凋亡的作用。4.SND1可作为转录共激活因子诱导MMP2基因的转录和MMP2蛋白的表达,故可促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭。miR-361-5p表达异常降低所致SND1和MMP2过表达是胶质瘤细胞获得活跃迁移侵袭能力的重要分子机制。提高胶质瘤细胞中miR-361-5p含量可通过敲低SND1抑制MMP2的表达,从而发挥抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的作用。5.本研究结果丰富和深化了对胶质瘤发生发展分子机制的认识,为胶质瘤分子病理诊断、良恶性分级和患者预后评估筛选了可靠的分子标记物。同时,本研究鉴定了两种胶质瘤抑瘤miRNA和三种胶质瘤促瘤因子,为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗新策略的制定提供了可能的治疗因子和干预靶点。