论文部分内容阅读
Jingzhaotoxin-V (JZTX-V)是敬钊缨毛蛛中分离得到的多肽毒素,其相对分子质量为3605.73,它能够选择性的作用于瞬时外向钾电流Kv4.2和Kv4.3,但对Kv1.4和Kv4.1没有明显的抑制作用。Kv4.2通道属于瞬时外向钾通道,在心脏和大脑中大量表达,通常与癫痫、心律失常等疾病相关。KChIP2是Kv通道一种重要的辅助性亚基,对心脏的心室壁中Kv4通道电流的调节起着不可或缺的作用。为了更好的研究天然状态下在心肌组织中Kv4.2通道的结构和功能,我们在HEK293T细胞上共表达了Kv4.2和KChIP2的复合体,并用JZTX-V来检测它们相互作用。本研究通过膜片钳检测发现,JZTX-V能有效的抑制瞬时外向钾电流Kv4.2+KChIP2 (IC50为13.0±0.9 nM),10nM的JZTX-V对Kv4.2通道的激活和失活并无明显影响。为了检测JZTX-V在Kv4.2通道上的作用位点,我们对Kv4.2通道胞外连接环S1-S2, S3b-S4上的氨基酸残基进行了丙氨酸突变后,发现S1-S2上的氨基酸对通道与JZTX-V的结合没有明显影响,但S3b上的Kv4.2的突变体1275A和L277A分别增强JZTX-V和Kv4.2的亲和力10倍、20倍,S3-S4胞外连接环上Kv4.2的突变体V285A, F289A,V290A形成疏水性斑片能明显地减弱JZTX-V和Kv4.2的亲和力5、13倍,这些氨基酸残基很可能是JZTX-V结合Kv4.2通道的关键残基。但是当L277和V290分别突变成缬氨酸(V)和亮氨酸(L)后,对其IC50没有很大影响。JZTX-V对突变体L277V的半有效抑制浓度为6.3±2.0nM,是其对野生型的一半；JZTX-V对突变体V290L的半有效抑制浓度为15.1±1.2 nM, 与其对野生型的影响相似。为了进一步研究JZTX-V与Kv4.2通道相互作用的分子机制,通过多肽固相化学合成的方法成功的合成了JZTX-V的15个突变体。检测毒素突变体和Kv4.2的亲和力发现,W5A, M6A, W7A, R20A, K23A的IC50分别能增大13,23,13,9,14倍,W5、M6、W7形成一个暴露在毒素表面的疏水性斑片是JZTX-V和Kv4.2作用的关键残基。带负电荷的残基R20,K23可能通过静电力与通道相互作用。以上结论表明JZTX-V至少以两种方式与Kv4.2相互作用：JZTX-V上的疏水性残基(W5,M6,W7)形成一个疏水性斑片与Kv4.2胞外连接环S3-S4的疏水性斑片(V285,F289,V290)通过疏水力相互作用；Kv4.2 S3b上的1275和L277形成的空间构象阻碍了毒素与通道的相互作用。这种作用机制与以往的毒素不同,因此JZTX-V可以作为钾通道结构和功能研究的工具试剂。