论文部分内容阅读
研究背景：UBE3A（E6-AP）作为泛素-蛋白酶体系统中的重要成员，是泛素蛋白连接酶（E3酶）之一。UBE3A和宫颈癌有密切关系，其与宫颈癌细胞中HPV16编码的E6原癌蛋白形成E6／E6-AP蛋白复合物，并通过泛素-蛋白酶体途径降解P53蛋白。近年来研究发现，UBE3A在多种肿瘤细胞中表达异常，如前列腺癌、宫颈癌以及乳腺癌等，许多重要细胞内蛋白，如BAK, c-MYC, p27, Mcm-7, PR-B annexinA1等，均通过UBE3A介导的泛素-蛋白酶体途径被降解。在乳腺癌中，UBE3A的具体作用机制目前仍不完全清楚。膜联蛋白A2作为膜联蛋白家族中的重要成员之一,研究发现膜联蛋白A2在很多肿瘤中表达异常,且在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。在乳腺癌细胞中，通过RNA干扰敲减膜联蛋白A2可使乳腺癌细胞的浸润转移能力减弱,因此膜联蛋白A2可能在乳腺癌中扮演着重要角色。我们前期研究发现膜联蛋白A2在乳腺癌组织中过表达，且存在异常的泛素化,提示膜联蛋白A2可能通过泛素化途径参与乳腺癌的病理过程， UBE3A可能在这一过程中起重要作用。因此本课题采用RNA干扰阻低UBE3A基因在乳腺癌BT-549细胞中的表达，从而探讨UBE3A基因在乳腺癌发生发展中的作用，以及其是否参与调解膜联蛋白A2在乳腺癌细胞中的表达而发挥相应的功能。目的：探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默UBE3A的表达对annexinA2的表达以及乳腺癌BT-549细胞增殖、凋亡和侵袭的影响；方法：使用siDirect Version2.0软件，设计UBE3A基因的3条特异性siRNA片段及1条无关序列siRNA,分别为UBE3A-siRNA1、UBE3A-siRNA2、 UBE3A-siRNA3和negative-siRNA；用脂质体Lipofectamine2000将siRNAs转染至乳腺癌BT-549细胞内；分别用半定量RT-PCR及westernblot检测BT-549细胞中UBE3A基因干扰前后mRNA和蛋白表达变化；同时检测annexinA2基因在UBE3A基因干扰前后mRNA和蛋白表达变化；CCK-8试剂盒法检测乳腺癌BT-549细胞RNA干扰后24h、48h、72h以及96h后细胞增殖情况；流式细胞术检测BT-549细胞RNA干扰72h后凋亡情况；transwell小室侵袭实验检测BT-549细胞RNA干扰后侵袭能力的变化。结果：乳腺癌BT-549细胞转染后72h，实验组UBE3A-siRNA1、UBE3A-siRNA2、UBE3A-siRNA3与空白组、阴性对照组、脂质体组相比,3个转染特异性siRNA组的UBE3A基因mRNA表达水平下降，其中siRNA1组mRNA下降最显著；蛋白水平与基因水平结果一致。在UBE3A基因敲减后， annexinA2基因mRNA和蛋白表达均下降，且癌细胞增殖能力较空白组、阴性对照组减弱，凋亡较空白组、阴性对照组增加，侵袭能力较空白组、阴性对照组减弱。结论：敲减UBE3A基因可使annexinA2表达下调，同时可抑制乳腺癌BT-549细胞的增殖，诱导细胞凋亡，减弱细胞的侵袭，UBE3A基因可能通过调节annexinA2的表达从而影响乳腺癌细胞BT-549的增殖、凋亡及侵袭能力。