牛副流感(Bovine parainfluenza)是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)引起的一种急性接触性传染病,曾被称为“船运热”(Shipping fever)。发病牛食欲不振,精神萎靡,有流涕、流泪和咳嗽等呼吸道病症状,个别牛体温升高,表现严重的牛发生呼吸困难。在运输和寒冷等应激情况下可继发细菌或支原体感染,如多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体等,从而引起严重的支气管肺炎,导致牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC),使死亡率大大增加。BRDC在全球范围内对养牛业造成极大的危害,给养牛业带来严重的经济损失。病原学诊断和血清流行病学检测均显示BPIV3感染在我国流行较广,因此我国目前迫切需要研发有效的BPIV3疫苗,以便对BPIV3感染实施有效的防控。本研究将BPIV3 SD0835株在细胞上进行多次传代,评估高代次病毒对豚鼠致病性,筛选可以作为弱毒疫苗的候选毒株。首先将分离到的野毒SD0835株在MDBK细胞中进行传代,连续进行了207次,以期达到降低其致病性的目的。我们选择了3个高代次的病毒(P126、P151和P208),研究它们对豚鼠的致病性,和野毒BPIV3 P2进行比较。结果显示,高代次病毒对豚鼠的致病性降低,主要表现为高代次病毒感染豚鼠后导致动物发热的数量减少,在肺脏中复制的滴度显著下降,也不会导致肺脏出现显著的眼观病变,而且都可以诱导豚鼠产生一定滴度的中和抗体。病理学组织观察显示P126和P151组豚鼠肺脏呈现肺泡间隔增宽等病变,和野毒组豚鼠肺脏病变非常相似。值得注意的是,P208代次毒感染豚鼠后没有导致其死亡,肺脏病毒滴度减少,尤其是病理结果显示该组豚鼠肺脏组织病理学病变程度与其他代次毒感染组相比减少很多,有的豚鼠肺脏没有病变,接近空白对照组。综合上述实验获得的结果,可以初步确定BPIV3 P208代次毒通过鼻内感染对于豚鼠是安全的,并且可以诱导其产生病毒中和抗体,该毒株可以作为弱毒疫苗的候选毒株,因此后期可以将该毒株在本动物牛上进行免疫和攻毒实验,以验证其安全和有效性。目前我国还没有相关的BPIV3疫苗研究和商品化的疫苗。之前的研究已经表明,BPIV3经过细胞传代后,其对豚鼠的致病性是显著降低的,而且可以诱导机体产生中和抗体。因此我们将BPIV3 P208作为弱毒疫苗候选株,免疫豚鼠后攻毒,评价其安全性和有效性。结果显示肌肉注射免疫豚鼠后,豚鼠直肠温度正常也没有产生任何临床症状,说明该弱毒疫苗株有较好的安全性;经过加强免疫后,豚鼠产生了高滴度的中和抗体,而且CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的比例上升。攻毒后免疫的豚鼠没有死亡的现象,呼吸道中几乎分离不到病毒;而未免疫组的豚鼠有死亡的现象,呼吸道中病毒滴度较高,这说明该疫苗可以有效保护豚鼠免受强毒的攻击。攻毒后我们也检测了CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的比例,发现免疫组和空白对照组豚鼠都出现不同比例的下降,空白对照组下降的比例更大。总之,BPIV3的P208代次毒作为一个弱毒疫苗候选株具有较大的应用前景和价值。BPIV3通过细胞传代后,其致病性降低,然而相关的分子基础尚不清楚。我们测定了BPIV3 P2和数株高代次病毒的F和HN基因序列,测序结果显示F和HN基因一共发生了14个有义突变,导致相应的14个氨基酸的改变,这些突变可能与BPIV3细胞传代毒的致病性降低有关。而想要鉴定这些突变和毒力致弱的关系,构建病毒的感染性克隆是必不可少的。本研究将BPIV3分为7个节段,分别通过人工合成和RT-PCR的方法获得,通过合适的酶切位点进行拼接,构建了BPIV3全长基因组。同时也构建了表达核蛋白、磷蛋白和聚合酶蛋白的辅助质粒,免疫荧光显示这些辅助质粒都能在哺乳类动物细胞中表达。将BPIV3全长基因组cDNA和3个辅助质粒共转染MDBK细胞,进行了病毒的拯救,但现阶段尚未拯救成功。综上所述,BPIV3经过207次细胞传代之后,高代次病毒在细胞上繁殖能力和亲本毒株相当。致病性实验结果表明,高代次病毒尤其是P208毒株对豚鼠的致病力显著下降,主要表现在不会导致豚鼠死亡、病毒在肺脏中复制滴度减少、肺脏无眼观病变、肺脏病理组织学变化也显著减少,同时病毒仍然可以诱导动物产生中和性抗体,说明BPIV3 P208株可以作为疫苗候选株。将该疫苗候选株肌肉注射豚鼠,豚鼠没有表现出任何临床症状也没有病毒血症的发生,说明该疫苗株是安全的。该疫苗可以诱导动物机体产生体液免疫,还可以刺激淋巴细胞增殖。攻毒实验表明免疫后的豚鼠可以抵抗亲本毒的感染,表现在免疫组豚鼠没有死亡,肺脏和气管病毒滴度显著下降,说明该疫苗株是安全和有效的。BPIV3在传代过程基因发生了较多突变,阐明哪些基因突变导致了病毒的致弱需要相应的反向遗传系统。因此我们成功的构建了BPIV3全长cDNA和3个辅助质粒,为反向遗传系统的建立打下了基础。