1.背景与目的肌腱损伤修复术后形成限制性粘连对手外科医生而言是一个巨大的挑战。目前，临床上通常使用无滑膜肌腱段作为移植材料修复屈肌腱缺损。但是，在愈合过程中通常都伴随有术后粘连的发生。这主要是由于无滑膜肌腱表面没有滑膜组织覆盖。滑膜在肌腱愈合与粘连防治中发挥着重要的作用。它通过阻止外源性成纤维细胞的过度增生以及腱周组织与肌腱的接触抑制了外源性愈合；滑膜分泌的滑液能促进肌腱滑动，减少摩擦，营养肌腱，增强肌腱的内源性愈合。如果能使易于取材的无滑膜肌腱表面形成滑膜组织，即无滑膜肌腱滑膜化，将对粘连防治起到巨大的作用。为此，我们一直在寻找简单有效地无滑膜肌腱滑膜化方法。2003年，日本科学家在类风湿性关节炎病人的滑膜细胞中发现了一种新基因synoviolin。它是一种E3泛素酶，含有RING-H2基序和六个跨膜结构域，主要定位在内质网上，它在内质网相关蛋白降解系统（ER-associated degradation）中发挥重要的作用。Synoviolin在风湿关节炎病人的滑膜细胞中表达增高，它通过抑制滑膜细胞凋亡使滑膜细胞过度生长和增殖。既然synoviolin能够使滑膜细胞增殖，而无滑膜肌腱滑膜化可以有效地防粘连，如果将过表达synoviolin的滑膜细胞包裹在无滑膜肌腱周围，将可能在肌腱表面形成一层滑膜，从而促进肌腱的愈合并减轻粘连的发生。本课题的目的就是明确synoviolin对滑膜细胞的增殖作用，探讨过表达synoviolin使无滑膜肌腱滑膜化的可行性及有效性，为无滑膜肌腱滑膜化抗粘连提供简单有效的方法。2.方法2.1synoviolin慢病毒表达载体的构建利用Gateway技术构建增强绿色荧光蛋白（EGFP）和synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体，通过与包装质粒共转染293FT细胞，包装生产慢病毒，经超速离心浓缩收集病毒颗粒，采用转染293FT细胞的方法测定慢病毒功能滴度，为后续研究提供了高效的转基因平台。2.2synoviolin在滑膜细胞的表达及对其增殖、HA分泌的作用采用酶消化法分离纯化原代滑膜细胞，免疫组化染色对其进行鉴定。慢病毒感染滑膜细胞后，RT-PCR和Western Blot检测synoviolin mRNA和蛋白质表达水平。采用MTT法和流式细胞术检测synoviolin对滑膜细胞增殖的影响，ELISA技术检测过表达synoviolin后滑膜细胞分泌透明质酸的情况。2.3synoviolin促进功能性滑膜形成的作用手术分离取出兔的无滑膜肌腱段，将Lenti-synoviolin和Lenti-lacZ感染的滑膜细胞分别与肌腱共培养，体外进行无滑膜肌腱的滑膜化。HE染色和扫描电镜观察肌腱表面滑膜形成情况，切片细胞计数比较滑膜形成的速度，阿辛蓝染色法检测共培养形成的滑膜分泌透明质酸的情况。3.结果3.1synoviolin慢病毒表达载体的构建3.1.1PCR扩增获得含SalI和BamHI酶切位点的synoviolin目的基因片段；3.1.2将目的基因连接到pMD18-T载体中进行扩增；3.1.3经酶切、连接、转化等步骤后得到真核表达载体pIRES2-synoviolin-egfp；3.1.4双酶切获得synoviolin-egfp基因片段，将其克隆至pENTR1A的多克隆位点得到入门克隆pENTR1A-synoviolin-egfp；3.1.5利用Gateway技术的LR重组反应将synoviolin-egfp基因片段转入目的载体，获得慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-synoviolin-egfp；3.1.6将慢病毒表达载体与包装质粒共转染293FT细胞，包装获得慢病毒；3.1.7超速离心浓缩收集病毒颗粒，转染293FT细胞后通过荧光表达测定病毒滴度。Lenti-synoviolin的病毒滴度为1×108TU/mL。3.2synoviolin在滑膜细胞的表达及对其增殖、HA分泌功能的影响3.2.1滑膜细胞的形态及鉴定原代培养的滑膜细胞经HE染色，普通光镜下，细胞呈梭型或柱形，细胞核呈卵圆形位于细胞中央，核仁明显。免疫组化染色检测发现滑膜细胞对vimentin蛋白表达阳性，CD14、CD68蛋白表达阴性，说明该细胞来源于中胚层，并具有成纤维细胞的特点，是滑膜细胞B型细胞，即成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)。3.2.2滑膜细胞转染Lenti-synoviolin后过表达synoviolin慢病毒感染滑膜细胞48h后，RT-PCR及Western blot检测发现，与对照组相比，Lenti-synoviolin感染滑膜细胞后synoviolin基因的mRNA和蛋白水平均有显著的增高。3.2.3过表达synoviolin促进滑膜细胞增殖并改变其细胞周期采用MTT法分析发现，与对照组相比，滑膜细胞转染synoviolin48h后增殖能力显著增强（P<0.01）。流式细胞术检测细胞周期发现，G1期细胞比例小于对照（P<0.05），S期细胞比例显著高于对照（P<0.01），细胞增殖指数高于对照（P<0.05），提示过表达synoviolin对滑膜细胞有促进增殖的作用。3.2.4过表达synoviolin促进滑膜细胞HA分泌增加为了检测synoviolin对滑膜细胞HA分泌能力的影响，我们使用兔透明质酸ELISA试剂盒对感染Lenti-synoviolin的滑膜细胞进行了检测。结果发现，病毒感染滑膜细胞后，细胞上清HA含量均有显著升高，其中24h和48h（P<0.05），72h（P<0.01）。提示过表达synoviolin有促进滑膜细胞分泌HA的作用。3.3synoviolin促进功能性滑膜形成的作用3.3.1过表达synoviolin促进滑膜的形成滑膜细胞感染Lenti-synoviolin或Lenti-lacZ后，分别与无滑膜肌腱体外共培养3天和7天后，HE染色和扫描电镜观察到肌腱表面可见细胞附着生长并形成细胞层。通过对肌腱表面的细胞计数，结果显示，过表达synoviolin组肌腱表面滑膜细胞数量明显高于对照组，提示过表达synoviolin能加速滑膜的形成3.3.2共培养肌腱具有分泌HA的功能滑膜细胞与无滑膜肌腱共培养3天后阿辛蓝染色观察发现，Lenti-synoviolin和Lenti-lacZ组在0.06M MgCl2浓度时染色均呈阳性，而在MgCl2浓度为1,2.61,3.56时，两组染色均呈阴性。这个现象说明肌腱表面有细胞合成的酸性粘多糖（透明质酸）存在，提示共培养肌腱具有分泌HA的功能。4.结论4.1过表达synoviolin促进滑膜细胞的增殖；4.2过表达synoviolin促进滑膜细胞透明质酸的分泌；4.3过表达synoviolin促进功能性滑膜的形成。