极地抗植物病原真菌活性菌株PKS和NRPS基因的克隆与步移

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极地是一个微生物资源宝库,其微生物具有种质的新颖性和多样性。由于极地特殊的环境特征,有可能从生存于其中的极地微生物中发现结构新颖的生物活性物质。对极地微生物活性物质生物合成的有关功能基因进行研究,可为从生物合成途径深入研究其次级代谢产物提供分子生物学的证据,并为今后其开发利用极地微生物次级代谢产物的生物合成提供基因资源。以尖孢镰刀菌为指示菌,采用平板扩散法对实验室保藏的38株极地活性菌株进行了活性验证。研究结果表明,38株极地菌株中,有13株极地菌株抑菌活性稳定且明显,其中菌株C-1、11W、83-1、195、2-Z18和P406抑菌效果较好。对研究获得的抑菌活性显著且稳定的13株极地菌株进行了基于16s rRNA基因的分子鉴定与系统发育分析。结果表明,13株活性菌株分别属于3个属;其中11株属于假单胞属(Pseudomonas),1株属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter),1株属于节杆菌属(Arthrobacter)。分别利用简并引物PKS-D/PKS-U和NRPS-D/NRPS-U对13株极地活性菌株进行了多聚酮合酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因的扩增。研究结果表明,在13株活性菌株中,从5株菌株中扩增到PKS I型KS结构域片段,阳性率为38.5%;从10株菌株中扩增到NRPS基因A结构域片段,阳性率为76.9%;从5株活性菌株(C-1、P499、83-1、P406和205)同时克隆到PKS和NRPS基因,菌株C-1和P499均扩增出2条NRPS基因片段,都值得进一步深入研究。选取菌株Pseudomonas sp.83-1为研究对象,利用基因步移技术对其NRPS和PKS基因两侧未知序列分别进行了扩增。研究结果表明,对菌株Pseudomonassp.83-1NRPS基因成功进行了4次步移,向其5′端共延伸5118bp;对菌株Pseudomonas sp.83-1PKS基因成功进行了2次步移,向其5′端共延伸1622bp。对经基因步移后获得的NRPS基因序列进行了ORF的分析,共发现3个较为完整的ORF;其中ORF1编码了NRPS模块中的A(adenylation)域,ORF2编码了NRPS模块中的C(condensation)域,ORF3编码了NRPS模块中的1个A域和2个C域。本实验对极地抗植物病原真菌活性菌株的PKS和NRPS基因的研究取得了一定的进展,为从聚酮和非核糖体肽等生物合成途径深入研究活性菌株的次级代谢产物提供了基因学证据,有利于进一步了解代谢产物的分子调控机制,预测可能产生的化合物类型。
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