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实验目的胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。据世界卫生组织统计,世界上每年胰腺癌新发病例约为21.6万人,占全部恶性肿瘤的2%,但是胰腺癌的死亡率非常高,与发病率十分接近,在癌症死因中占第4位。胰腺癌的治疗仍然是非常棘手的临床问题。手术切除是目前首选的治疗方式,但由于受胰腺解剖学及生物学特征等因素的影响,确诊时多属晚期,手术切除的机会只有15%～20%甚至更低,而且术后仍有复发转移。近年来,胰腺癌的药物治疗已经有了显著的进步,化疗已成为必不可少的治疗手段之一,分子靶向药物治疗也已成为目前研究的热点。信号转导子和转录激活子（signal transducers and activators of transcription,STATs）是1992年研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个胞浆蛋白家族,是根据它们在信号转导中的作用来命名的,它们接收特异的细胞表面受体信号并进行转导,从而使细胞内其下游靶基因的转录发生改变。迄今为止,人们已经确认了7种不同的STAT分子,包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6。STAT3是其重要成员,在许多人类肿瘤中活化,具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生和发展。近年来,以STAT3为靶点的治疗措施取得了很大进展,通过直接或间接阻断STAT3信号通路抑制肿瘤细胞和异种移植瘤的STAT3活化,抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡。葫芦素（Cucurbitacins）是从葫芦科及其它科属多种植物中提取的成分,至今已发现40多种,其中以葫芦素B、E应用最广。葫芦素具有抗肿瘤、抗化学致癌、保肝、提高机体免疫力等多种生物活性。近年的多项研究表明,葫芦素B、D、E、I、Q等是JAK/STAT3信号通路的特异抑制剂,能降低多种癌细胞的STAT3活化水平,并降低STAT3的DNA结合能力和STAT3介导的基因转录,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制异种移植瘤生长。Jayaprakasam等报道,葫芦素B对结肠癌、乳腺癌、肺癌和中枢神经系统肿瘤都有明显的抑制作用。我们前期的研究显示葫芦素B对喉癌和肝癌也具有增殖抑制作用,但关于葫芦素B对胰腺癌的作用尚未见报道。吉西他滨（gemcitabine,difluorodeoxycytidin,dFdC）是晚期胰腺癌的标准治疗药物,但单用吉西他滨对患者生存期的影响还很有限,因此除了不能耐受强烈化疗或参加新药试验的患者,临床上经常采用联合化疗治疗晚期胰腺癌。目前多采用吉西他滨联合其他抗肿瘤药物,包括:一些传统药物如5-氟尿嘧啶、铂类药物,新一代细胞毒药物如多西紫杉醇以及分子靶向药物如埃罗替尼等。吉西他滨联合化疗与其单药应用相比,能够提高总生存期、客观缓解率及无进展生存期等,但患者5年生存率仍较低。吉西他滨与分子靶向药物联合是目前研究的热点,且有关葫芦素B与吉西他滨联合应用对胰腺癌抑制作用的研究尚未见报道。本研究应用MTT法、流式细胞术、荧光染色、活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测以及Western blot等方法,研究葫芦素B单独或联合吉西他滨对胰腺癌细胞系PANC-1体外的增殖抑制作用,并探讨其机理。材料和方法不同浓度葫芦素B单独或联合吉西他滨作用于PANC-1细胞一定时间后,利用MTT法检测计算细胞增殖抑制率并探讨两者联合是否具有协同作用,流式细胞仪PI单染检测细胞周期分布的变化,Hoechst 33258核染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞仪Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡率,活性氧探针（2,7-二氯荧光素）探测PANC-1细胞内活性氧水平的变化,最后利用Western Blot技术检测细胞内p-STAT3及凋亡相关蛋白Bcl-2、p53及其下游蛋白p21等的表达。结果1、MTT法实验结果显示葫芦素B与吉西他滨单独或是联合应用,对PANC-1细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经单因素方差分析,P＜0.01。经LSD-t检验,用药组与对照组之间、高剂量组与低剂量组之间、不同时间组之间以及联合用药组与单药组之间,差异均有统计学意义（P＜0.05或＜0.01）。2、PI单染流式细胞仪检测结果显示葫芦素B导致PANC-1细胞G2/M期阻滞,同时伴有G0/G1期细胞减少,并具有剂量依赖性和时间依赖性;吉西他滨则使阻滞于S期的细胞增多;两者联合应用,同时阻滞细胞于S期和G2/M期,且阻滞细胞所占比例明显升高。经单因素方差分析,P＜0.01。经LSD-t检验,不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间、以及联合组与单药组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05或＜0.01）。3、Hoechst 33258染色荧光显微镜观察发现,随着葫芦素B或吉西他滨浓度增加和作用时间延长,细胞形态发生显著性改变,凋亡细胞明显增多,甚至出现大片细胞脱落形成细胞脱失区,两药联合应用后效果更加明显。经单因素方差分析,具有统计学意义。经LSD-t检验,P＜0.05或＜0.01。4、Annexin V/PI双染流式细胞仪检测结果显示,联合用药组较阴性对照组和单药组细胞凋亡比例明显升高。经单因素方差分析,具有统计学意义。经LSD-t检验,不同浓度组与对照组之间、各浓度组之间以及联合组与单药组之间,P＜0.01。5、活性氧探针（2,7-二氯荧光素）检测结果显示,葫芦素B或吉西他滨单独作用于PANC-1细胞后胞内活性氧水平升高,并呈时间和剂量依赖性。两者联合作用下细胞内活性氧水平显著升高。经单因素方差分析,具有统计学意义。经LSD-t检验,不同浓度组与对照组之间、联合用药组与单药组之间相比较,P＜0.01。6、Western blot结果显示葫芦素B可以时间和剂量依赖性抑制STAT3的磷酸化和抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达,活化抑癌蛋白p53和p21的表达。两药联合作用,pSTAT3则几乎完全被抑制,p53蛋白水平表达较对照组升高。结论1、葫芦素B可以剂量和时间依赖性抑制胰腺癌PANC-1细胞的生长;葫芦素B和吉西他滨联合应用共同抑制PANC-1细胞的增殖抑制,且作用较单药明显。2、葫芦素B抑制胰腺癌PANC-1细胞的作用是通过诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡来实现的,并具有剂量和时间依赖性;两药联合作用细胞同时阻滞于S期和G2/M期,且阻滞细胞比例较单药组明显增加。3、葫芦素B可以剂量依赖性地增加胰腺癌细胞内ROS的产生;两药联合作用,细胞内ROS水平增加显著。4、葫芦素B抑制胰腺癌PANC-1细胞的作用机理可能是通过抑制STAT3信号通路的活化,进而抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,增强p53和p21蛋白的表达;联合用药组pSTAT3水平明显抑制,且p53蛋白表达升高。