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第一章胎盘植入中 microRNA-125a,microRNA-29a/b/c 和MCL1表达水平分析[研究目的]1.检测并分析miR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入部分与自身邻近非植入组织中的表达是否存在差异。2.检测并分析植入和自身邻近非植入组织中MCL1基因mRNA水平的表达及差异,并分析MCL1与miR-125a和miR-29a/b/c表达相关性。3.探讨MCL1是否作为miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因在胎盘植入中发挥作用。[研究方法]1.采用自身对照的配对设计,收集新鲜未经任何干预处理的母体面胎盘绒毛、类纤维蛋白层及基板层,植入部分还包括基板子宫肌层纤维。2.提取组织中总RNA,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链(RT-qPCR)反应检测胎盘植入部分及自身邻近非植入部分组织中miR-125a,miR-29a/b/c和MCL1的表达。3.应用载体(pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression Vector,pmirGLO)构建野生型 MCL1-miR-125a-pmirGLO 质粒(WT-125)和野生型MCL1-miR-29a/b/c-pmirGLO质粒(WT-29)。突变野生型质粒中的种子区序列部分碱基成为突变型MCL1-miR-125a-pmirGLO质粒(MUT-125)和突变型MCL1-miR-29a/b/c-pmirGLO 质粒(MUT-29)。用化学合成方法以 miR-125a 或miR-29a/b/c成熟核苷酸序列为模板分别合成microRNA模拟物,通过脂质体Lipofectamine 3000 将 miR-125a 模拟物与 WT-125 或者 MUT-125 共转染入293T细胞,将miR-29a/b/c与WT-29或者MUT-29共转染入293T细胞。4.双荧光素酶报告基因检测探讨MCL1与miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因关系。[结果]1.MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入部分组织中的表达水平明显低于自身邻近非植入部分组织,对应的表达倍数分别是0.64;0.63;0.64;0.75(p=0.005;0.018;0.041;0.022)。2.MCL1基因的mRNA在胎盘植入部分组织中表达水平明显高于自身邻近非植入部分组织,表达倍数为1.32(p=0.039)。3.Pearson相关分析表明,胎盘植入组织中miR-125a和miR-29a/b/c的相对表达量与MCL1的相对表达量呈显著负相关性(Pearson correlation =-0.701,-0.543,-0.876,-0.767,p<0.05)。4.双荧光素酶报告基因检测(luciferase activity assays)证实MCL1是miR-125a 和 miR-29a/b/c 的靶基因(p=0.043,0.006,0.009,0.010)。[结论]MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入组织较自身邻近非植入组织表达水平显著降低,相反MCL1mRNA在胎盘植入部分组织中表达显著增高,两者在胎盘植入中的相对表达量呈明显的负相关性。双荧光素酶报告基因检测证实 MCL1 是 miR-125a 和 miR-29a/b/c 的靶基因,推测 miR-125a,miR-29a/b/c通过调控靶基因MCL1表达参与胎盘植入发生。第二章胎盘植入中 microRNA-125a 和 microRNA-29a/b/c 调控滋养细胞生物学行为的研究[研究目的]1.体外转染滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞,进一步验证miR-125a和miR-29a/b/c对靶基因MCL1的负性调节作用。2.探讨miR-125a和miR-29a/b/c异常表达对滋养细胞凋亡生物学行为的影响。3.确定抗凋亡滋养细胞的类型,初步探讨miR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入中的病理作用机制。[研究方法]1.以miR-125a和miR-29a/b/c成熟核苷酸序列为模板,用化学合成方法分别合成 microRNA 的模拟物(miR-125a mimic,miR-29a/b/c mimics),反义的microRNA 抑制物(miR-125a inhibitor,miR-29a/b/c inhibitors)以及各自对应的阴性对照序列(negative control,NC,inhibitor negative control,INC)。通过脂质体Lipofectamine 3000分别将模拟物、抑制物及各自对应的阴性对照序列转染滋养细胞系HTR-8/SVneo。2.应用RT-qPCR反应检测microRNAs转染后HTR-8/SVneo细胞中MCL1 mRNA水平表达量的变化。应用Western Blot方法检测转染后HTR-8/SVneo细胞中Mcl1蛋白水平表达量的变化。3.应用AnnexinV/PI对转染后的HTR-8/SVneo细胞进行双染,应用流式细胞仪检测HTR-8/SVneo细胞凋亡率。4.对切除的子宫和胎盘组织进行组织病理切片,免疫组化染色病理组织切片定位Mcl1表达细胞类型,结合H&E染色观察细胞形态、数量。[结果]1.转染HTR-8/SVneo细胞后,miR-125a和miR-29a/b/c模拟物转染组中MCL1 mRNA表达水平较阴性对照组明显下降,表达倍数为0.60,0.42,0.58,0.43(p =0.0497,0.002,0.008,0.013);模拟物转染组中MCL 的蛋白表达水平也明显降低。2.MiR-125a和miR-29a/b/c模拟物转染后,HTR-8/SVneo细胞凋亡率较阴性对照组呈现增长趋势。3.H&E染色和免疫组化染色病理切片均观察到种植部位中间型滋养细胞(ISIT)数量在植入部分基板子宫肌层纤维间隙明显增多,免疫组化染色显示MCL1主要在ISIT中表达。显微镜下发现,相比于非植入部分,植入部分中间型滋养细胞细胞迁移至深部肌层内血管壁内现象更常见。[结论]MiR-125a或miR-29a/b/c的过表达可显著降低MCL1基因mRNA和蛋白的表达并促进HTR-8/SVneo细胞的凋亡。植入部分基板子宫肌层纤维间隙中主要表达MCL1的ISIT数量明显增多。以上结果提示植入胎盘组织中miR-125a和miR-29a/b/c对靶基因MCL1异常调控导致植入部分基板子宫肌层纤维间隙中ISIT数量明显增多进而参与胎盘植入的发生。