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脂肪酶(Lipase)，国际生化联合会的命名分类编号为EC．3.1.1.3，中文系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶。脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中，属于α/β水解酶家族。脂肪酶在生物体中主要作用是水解三酰基甘油、二酰基甘油、单酰基甘油、甘油以及游离氨基酸的酯键等。家蚕脂肪酶1(BmLipase-1)是已被证实的对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)具有强烈抵抗作用的内源蛋白，而且其表达并不会因病毒攻击而应激上调。本论文本研究旨在探讨内源增量表达病毒抗性蛋白Bmlipase-1对病毒抗性的影响，以期为家蚕抗病育种提供新的思路。基于家蚕基因组精细图和全基因组序列，系统鉴定了家蚕脂肪酶基因，并对相关基因的结构及表达特征进行了分析。此外，通过基于piggyBac转座子的转基因技术，构建了肌动蛋白A4启动子和病毒基因IE1启动子启动的BmLipase-1的表达载体，显微注射获得转基因个体，并对转基因株系进行了病毒抗性检测。本文获得的主要研究结果如下：
1．家蚕脂肪酶的生物信息学分析。
基于序列的相似性及功能域保守性，在家蚕基因组数据库中检索可能的家蚕脂肪酶基因。成功地在家蚕中鉴定出了lipase基因家族的30个成员，染色体位置分析表明整个家族的成员比较分散，染色体定位分析显示Bmlipase-1位于第5号染色体上。结合进化树分析Bmlipase2基因可能与Bmlipase1互为重复基因。芯片数据显示家蚕的lipase主要分为三种，一种在脂肪体和生殖腺中表达，一种在中肠和血液中表达，一种在丝腺中表达。具有病毒抗性的Bmlipasel与果蝇lipase和人的lipase蛋白的同源性分别为56％和21％，组织芯片数据分析显示其在5龄3天的中肠和血液中表达，以中肠的表达量最高，发育时期芯片数据显示其在上簇以后不表达，同时BmNPV诱导芯片数据显示其表达量并不受病毒的诱导而发生变化。
2．增量表达Bmlipase-1的转基因表达载体的构建。
以家蚕5龄3天中肠cDNA中为模板，克隆了Bmlipase-1全长CDS，通过pMD19T—simpie、L4440、以及pSLfa1180fa和piggyBac[3xp3 EGFP afin]等多个基础载体，成功构建了增量表达Bmlipase-1的转基因表达载体pBac[IEIP—lipase—sv40-3×P3—EGFPafm]和PBac[A4P—lipase—sv40-3xP3—EGFPafm]。转基因载体通过酶切进行检测，并经测序确认正确。
3．转基因阳性个体的获得及分子检测。
利用构建的转基因载体，选择滞育性蚕品种大造作为受体材料，进行转基因注射，筛选含有标记基因EGFP的阳性个体，并进行多代培养，成功获得以IE1启动子启动Bmlipase-1表达的转基因系IEI—Bmlipase-1和以A4为启动子启动Bmlipase1表达的转基因系A4—Bmlipase-1。通过southem杂交、RT—PCR和定量PCR等技术对转基因阳性株系的转基因拷贝数和mRNA表达水平进行了检测。结果显示A4—Bmlipasel有3个拷贝，IE1—Bmlipase1含有1个拷贝。而在转录水平，转基因系统Bmlipase-1的mRNA的表达量明显高于非转基因大造品种，而且A4—Bmlipasel转基因系统的Bmlipase-1的mRNA的表达量高于IEI—Bmlipase1转基因系统。
研究结果显示，IEI—Bmlipase1转基因系在3龄期前Bmlipase-1的mRNA表达量与非转基因系统的差距不大，在4龄起之后的表达量明显提高。
4．转基因阳性株系的病毒抗性检测。
为了验证增量表达的BmNPV对蚕体病毒抗性的影响，我们对获得的IEI—Bmlipase1转基因系进行了攻毒检测。经ID50测试后设立2个病毒攻击浓度2.66×104和3.46×104。
对攻毒结果进行统计学分析，表明Bmlipase-1在攻毒后的第8天，浓度为2.66×104的转基因组1相较同浓度对照组1的抗病毒效果显著，死亡率降低20％左右，而浓度为3A6×104转基因组2的也有一定抗病效果，死亡率降低了15％左右。攻毒后5至8天的曲线图上显示转基因组与同浓度对照组相比，死亡时间延后。通过对攻毒后24小时以内的材料进行定量PCR分析，转基因组的lipase-1mRNA水平比对照组高，结合攻毒数据推测可能是lipase的增量表达产生了比较明显的抗病效果，从而在总体水平上使得转基因品系的死亡速度延缓。而因为继发感染等各种原因，导致后期蚕只大量死亡以至于死亡率变得非常接近。
综上所述，本论文基于家蚕全基因组精细图谱和全基因组表达芯片数据，系统鉴定和分析了家蚕的脂肪酶基因。成功构建了增量表达病毒抗性蛋白Bmlipase-1的piggBac转基因载体，经显微注射成功获得iel启动子启动Bmlipase-1表达的iel+lipase-1转基因系和A4为启动子启动Bmlipase-1表达的的A4+lipase-1转基因系，基因表达量分析表明，转基因系统的病毒抗性蛋白Bmlipase-1的表达量明显高于非转基因系统。对转基因系统进行病毒攻击测试，结果显示，较之于非转基因系统，转基因系统对BmNPV的抗性均呈现不同程度的提高。相关研究结果表明，基于转基因技术，内源增量表达病毒抗性蛋白也是增强宿主抗性的一种手段，为抗病品种选育提供了一定参考。