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β-1,4-D-甘露聚糖酶(endo-1,4-D-mannanase, EC3.2.1.78)是一种广泛应用于饲料和食品等行业中的半纤维素水解酶,具有重要经济价值。本研究将组成型产p-甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌中的α-factor信号肽替换成五种新信号肽(W1、MF4I、INU1A、αpre、HFBI)。对比α-factor信号肽,W1、MF4I、apre、HFBI信号肽改造菌株的相对酶活分别达到23.5%、203.5%、79.7%和120.3%,INU1A无胞外p-甘露聚糖酶活性。通过RT-PCR对p-甘露聚糖酶基因拷贝数进行测定的结果表明α-factor和MF4I两种重组子的MAN活力均于4个拷贝数时达到最大。替换MF4I信号肽的重组子在1-6个MAN基因拷贝数的水平上对比α-factor信号肽的重组子,提高的MAN活力分别达到66.30U/ml、90.56U/ml、133.37U/ml、173.97U/ml、102.92U/ml、102.26U/ml,相对酶活分别达到512.0%、209.0%、105.3%、100.2%、99.7%、105.2%。4个拷贝数的MF4I重组子MAN活力相对最大,可以达到347.5U/ml。选用SMD1168作为表达宿主的重组子的平均酶活只能达到X33宿主型的62.7%-64.1%。而将pPICZα-MAN质粒中的α-factor进行MF4I信号肽改造,重新构建得到的诱导型pAOX1MF41-MAN基因工程菌的酶活可以达到原来组成型pGAPZMF4IA-MAN基因工程菌中酶活最高水平的2.3倍,将其用于下一步高密度发酵。经单因素实验摸索发酵基础培养基氮源和碳源分别为27g/L的玉米浆干粉和20g/L的食品级葡萄糖,并在诱导流加培养基中新添加2g/L硫酸铵和0.5g/L油酸。综合信号肽和启动子改造优化后的产β-甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌经5L发酵罐高密度发酵后,产出的p-甘露聚糖酶最高活力从摇瓶的173.35U/ml提高至6890U/ml,总体提高幅度达到39.7倍。