背景胰腺癌是目前恶性程度最高的实体肿瘤,而且早期诊断十分困难,大部分患者初诊时就处于疾病中晚期,无法手术切除,而且对放化疗等内科治疗不敏感,因此总体5年生存率很低。近年来,我国胰腺癌的发病率和死亡率仍在不断上升,并已成为排名前十的最常见死亡相关癌症之一。因此,明确胰腺癌等恶性肿瘤发病的生物学机制,为肿瘤诊断和治疗提供新方法和新思路,无疑具有重要的科学价值和社会经济意义。作为第一个从人类肿瘤细胞中分离出来的癌基因,Ras基因在胰腺癌中的突变发生率非常高。大量研究表明,胰腺癌的发生发展与Ras信号通路的异常激活密切相关。已有研究发现,Ras信号通路异常激活导致的启动子甲基化失活是包括Fas在内的多个抑癌基因在恶性肿瘤中功能缺失的原因。DNA主动去甲基化是近年来表观遗传学领域的研究热点。5-甲基胞嘧啶在TET双加氧酶蛋白家族的催化下被不断氧化形成5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶,最终被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶介导的碱基切除修复途径还原为未修饰的胞嘧啶。同DNA甲基化一样,DNA主动去甲基化过程也具有重要的生物学意义,与细胞分化、个体发育以及恶性肿瘤等生理病理过程密切相关。因此,明确肿瘤发生过程中DNA主动去甲基化相关酶的表达调控以及作用机制,将对阐明表观遗传调控机制,认识肿瘤发病过程并探索新的肿瘤防治策略等具有重要意义。目的目前的DNA主动去甲基化调控研究大多集中在TET蛋白家族上,针对TDG的研究相对较少。在本文中,我们将以Ras基因突变率较高的胰腺癌为主要研究对象,分析Ras信号通路对TDG的表达调控及其作用机制。我们将首先明确TDG是Ras信号通路的下游调控靶点,并阐明其调控机制。然后分析其在胰腺癌细胞和病人组织样本中的表达情况及其与胰腺癌的相关性。在此基础上,探究TDG在胰腺癌发生发展中的功能及其作用机制。最后,通过分子生物学或生物化学手段改变TDG在细胞内水平以验证其功能,为胰腺癌治疗提供潜在的治疗靶点。方法为研究Ras信号通路对TDG表达的影响,我们:①分别运用免疫印迹和RT-PCR等方法比较转染活化型Ras前后细胞内TDG蛋白和mRNA的表达情况;②分别运用免疫印迹和RT-PCR等方法比较siRNA敲减Ras前后携带k-Ras基因突变的胰腺癌细胞内TDG蛋白和mRNA的表达情况;③利用免疫组化等技术检测TDG在人胰腺癌组织标本中的表达情况,分析TDG表达的临床意义。为研究Ras信号通路调控TDG表达的机制,我们:①克隆TDG不同长度启动子序列,采用荧光素酶报告基因系统,确定TDG的活性启动子区,分析Ras信号通路对该启动子活性的影响,并以此为基础,通过生物信息分析,筛选可结合该启动子的潜在转录因子。通过siRNA技术分别抑制这些潜在转录因子,发现抑癌基因ING4参与调控TDG表达;②构建ING4特异性结合位点的突变体,用荧光素酶报告基因系统检验其活性,进一步确定ING4对TDG的转录调控作用。转染ING4的过表达载体,改变其表达,观察TDG的表达变化。通过染色质免疫共沉淀技术验证TDG启动子与ING4的相互结合,并进一步比较Ras信号通路活化前后二者间相互作用的改变;③在Ras转化细胞中过表达或Ras敲减细胞中抑制ING4,比较TDG的表达情况,以验证ING4在Ras调控TDG表达过程中的作用。为验证TDG的功能及其作用机制,我们:①构建了TDG的过表达载体,观察过表达TDG前后肿瘤细胞的体外生长能力和小鼠体内成瘤能力;②用免疫印迹、流式细胞术、免疫组化等方法检测细胞增殖标记Ki-67、细胞凋亡标记caspase-3剪切等在过表达TDG前后的肿瘤细胞或组织中的变化,以确定TDG对细胞增殖、凋亡等的影响,并由此发现死亡受体Fas是TDG的调控靶点;③分别采用RT-PCR、免疫印迹或流式细胞检测法,分析过表达TDG前后肿瘤细胞中Fas的表达变化,并比较Fas配体(FasL)对TDG表达前后细胞的凋亡诱导作用,以验证TDG对Fas表达的调控作用;④通过RT-PCR和免疫印迹方法验证TDG对Fas的调控作用,并确定TDG调控Fas表达的方式。通过染色质免疫共沉淀等技术,分析TDG与Fas启动子间的相互作用,比较TDG过表达前后,Fas基因的启动子甲基化、组蛋白修饰以及相关转录调控因子与Fas启动子间相互作用的改变;⑤在前述研究的基础上,通过分子生物学(如基因敲除)或生物化学(如抑制剂)手段改变TDG或其调控因子在胰腺癌细胞中的表达或生物活性,初步检验TDG或其调控因子作为肿瘤治疗作用靶点的可能性。结果在本研究中,我们发现DNA主动去甲基化过程关键酶TDG是Ras信号通路的下游调控基因,在Ras突变的胰腺癌细胞和胰腺癌组织中,TDG表达显著下降。抑癌基因ING4通过与TDG启动子的特异性结合促进TDG转录表达,Ras信号通路以m-Calpain依赖的方式促进ING4蛋白的降解,间接抑制TDG的转录。TDG能够结合到死亡受体Fas基因的启动子区并招募组蛋白去甲基化酶JMJD3使组蛋白H3K27Me3去甲基化从而激活Fas的表达,在体内外诱导肿瘤细胞发生凋亡。Calpain抑制剂能够提高ING4的蛋白稳定性,使TDG、Fas的表达上调,从而提高肿瘤细胞的凋亡敏感性。结论通过以上研究,我们明确了Ras对TDG的表达调控作用及其机制,阐明了TDG的肿瘤抑制作用及其机制,并在体内外初步验证了 Calpain抑制剂作为一种潜在的胰腺癌靶向治疗药物的抗肿瘤效果,为胰腺癌诊治提供了新的作用靶点。