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研究背景:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,它可以通过不同的机制向特定器官转移,其主要转移部位为骨、肺和肝脏,是乳腺癌患者死亡的主要原因,但乳腺癌远处转移及转移器官倾向性的机制仍不清楚。因此,筛选与乳腺癌转移有关的调控分子,并探讨其具体的转移机制,对选择乳腺癌特异性器官转移的预测指标和治疗靶点具有重要意义。本实验室前期研究发现,KRAB锌指蛋白家族成员ZNF8可以通过TGFβ信号通路增强乳腺癌细胞体外和体内的转移能力,但其具体的功能及作用机制尚无文献报道。KRAB型锌指蛋白家族是哺乳动物中最大的转录调控因子家族,此家族在器官和组织的正常发育以及肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用,目前此家族中大多数成员的功能是未知的。TGFβ信号通路是人体最重要的信号通路之一。它能够调节细胞的分化、生长、增殖、衰老、迁移与粘连,以及胞外基质的合成和重塑等多种生命活动。在肿瘤的发生发展过程中,多种肿瘤细胞可以通过对TGFβ通路的选择性调控,影响肿瘤的进展和转移部位。但是目前TGFβ通路的活性调控具体机制仍不清楚。研究目的:1.确证ZNF8通过与Smads的相互作用调控TGFβ信号通路活性促进乳腺癌的转移。2.探讨ZNF8调控TGFβ信号通路活性促进乳腺癌转移的具体作用机制。研究方法:利用免疫共沉淀与质谱联合实验在高转移潜能的乳腺癌MDA-MB-231细胞中鉴定Samd3高可信的相互作用蛋白。利用GST-pulldown实验检测ZNF8与TGFβ信号通路分子Smad2和Smad3以及甲基化酶SMYD3体外的直接相互作用。分别构建ZNF8、Samd2、Smad3以及SMYD3的结构域截短体,利用免疫共沉淀实验技术鉴定四者分别相互作用的区域。构建ZNF8的C端缺失突变体,利用Transwell实验技术,确证ZNF8增加乳腺癌细胞迁移的结构域。利用免疫共沉淀实验技术检测ZNF8对Smad4与Smad2和Smad3,SMYD3与Smad3相互作用的影响;TGFβ处理条件下ZNF8与Smad2和Smad3相互作用的变化;ZNF8与甲基化酶SMYD3的相互作用。构建裸鼠尾静脉转移模型,确证ZNF8体内对乳腺癌MDA-MB-231细胞转移的影响,并验证ZNF8对乳腺癌细胞转移的影响是否依赖于TGFβ。利用磷酸化的Smad2和Smad3抗体以及Western Blot检测ZNF8对Smad2和Smad3的磷酸化水平的影响;利用细胞核质分离实验技术检测在MDA-MB-231细胞中ZNF8对Smad2和Smad3核质定位的影响。研究结果:1.乳腺癌MDA-MB-231细胞中Smad3的免疫共沉淀与质谱联合实验结果显示,ZNF8是Smad3高可信的相互作用分子。2.ZNF8与Smad2、Smad3以及甲基化酶SMYD3存在体外直接相互作用。3.Smad2和Smad3的C端MH2结构域介导其与ZNF8的相互作用,SMYD3的CTD结构域介导与ZNF8的相互作用,ZNF8的ZF结构域介导与Smad2和Smad3以及SMYD3的相互作用。4.ZNF8的C端结构域缺失以后,促进乳腺癌细胞发生侵袭转移的功能消失。5.TGFβ处理情况下,ZNF8与Smad2和Smad3的相互作用增强。6.ZNF8敲除情况下,Smad2、Smad3和Smad4三者之间的相互作用减弱。7.ZNF8可以促进尾静脉注射乳腺癌MDA-MB-231细胞的裸鼠发生肺转移,TGFβ促进ZNF8野生型乳腺癌细胞的肺部转移,但对ZNF8敲除乳腺癌细胞的肺转移能力无影响。8.ZNF8不影响Smad2和Smad3的磷酸化水平以及其核质定位情况。9.在HEK293T以及MDA-MB-231细胞中,ZNF8与SMYD3存在内源和外源的相互作用。10.在ZNF8敲除情况下,SMYD3与Smad3的相互作用减弱。研究结论和意义:ZNF8通过与Smad2和Smad3的相互作用参与了对TGFβ信号通路的调控,并以TGFβ依赖的方式促进乳腺癌细胞发生肺转移。ZNF8影响TGFβ信号通路的机制并不是通过影响Smad2和Smad3的磷酸化水平以及其核定位实现的。ZNF8通过募集SMYD3,增加Smad3与SMYD3的相互作用,调高靶基因调控区H3K4me3水平,促进靶基因转录,增强TGFβ信号通路的活性。本课题研究了一个新的参与TGFβ信号通路的调控因子,完善和补充了 TGFβ信号通路的调控机制,同时鉴定了一个新的乳腺肿瘤的侵袭转移的分子并揭示了相关机制,为乳腺癌的远处转移提供了特异性的预测指标和新的治疗靶点。