肺癌是目前全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年增长的趋势,由肺癌导致的死亡是全部恶性肿瘤的首位。肺癌的发生是多因素参与的多阶段过程,是环境因素和遗传因素共同作用的结果。DNA损伤是肺癌发生的重要早期分子生物学事件,焦化作业过程中产生的焦炉逸散物(coke oven emission, COE)中含有大量多环芳烃类化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs),可引起机体DNA损伤,是导致职业性焦炉工肺癌高发的重要原因。大量职业流行病学研究表明,即使是具有相似的外环境PAHs暴露水平的焦炉工人,DNA损伤程度存在明显差异,此外,只有少部分接触者最终发生肺癌,且发病的潜伏期长短不一,这提示个体的遗传背景决定了个体在接触环境PAHs暴露后的早期遗传毒性和肺癌易感性的差异。大多数肺癌患者在发病时己处于晚期,5年生存率仅约15%。肺癌患者的TNM分期和治疗方式是影响其预后的最主要临床特征,研究表明,位于同一TNM分期的不同个体接受同一化疗方案或药物的疗效存在明显差异,提示个体的基本特征及遗传背景决定了个体对放化疗的敏感性及患者的预后。热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)细胞内重要的机体应激保护性蛋白质,在受到热、氧化应激、毒物或其他应激反应之后迅速大量表达。HSPs作为分子伴侣,可参与新生蛋白质的合成、折叠、装配和转运至特定的细胞结构发挥其生物学作用,还可帮助变性或受损蛋白质的复性或降解。Hsp27和Hsp70是研究最为广泛的HSPs家族成员,两者可能通过发挥下列作用参与肿瘤的发生、发展和预后：(1)保护细胞或生物免遭各种有害应激因素的损害,从而赋予细胞从各种应激中恢复的能力、提高细胞的存活率；(2)作为分子伴侣维持细胞内蛋白质的正确结构和生物学活性,防止变性蛋白的不可逆性聚集,维持细胞内环境稳态；(3)可通过与重要的凋亡相关蛋白质相互作用参与抑制内源性或外源性细胞凋亡通路；(4)可通过与DNA修复酶相互作用而参与DNA损伤的修复过程。肺癌发生和预后的个体差异性可能与关键致病基因的遗传变异有关,我们推测位于Hsp27和Hsp70基因功能区域的单核苷酸多态性(single nucleotide po lymorphism, SNP)位点可能通过调节基因的表达量而影响其功能的发挥,进而影响个体的肺癌发病风险及肺癌患者的预后。本研究结合人群流行病学和体内外生物学研究,从“基因再测序_标签SNPs的选择→人群流行病学研究→基因型-表型研究SNPs功能研究”等多个层面系统地探讨了影响Hsp27和Hsp70表达的功能性SNPs对焦炉作业人群DNA损伤、肺癌易感性和预后的影响,以期为探索职业人群的个体防护措施和寻找肺癌发病及预后的生物学标志物提供科学依据。本研究共分为五部分：第一部分HSPB1基因多态性与肺癌易感性、预后的关联性研究Hsp27是小分子量热休克蛋白家族中的重要成员,在机体受到体内外应激因素刺激后迅速大量表达。研究表明Hsp27具有抑制细胞内源性和外源性凋亡通路的作用,且可作为许多肿瘤(如胃癌、肝癌、前列腺癌等)的预后标志物。本部分首先通过对60例健康的中国汉族人群的HSPB1基因进行再测序,根据测序结果构建出该基因的单体域(Haploblock),选择出3个tagSNPs,分别为-1271G>C、-1230G>A和-870T>C位点。在武汉1152对肺癌病例对照人群中对上述3个tagSNPs进行基因分析,多元logistic回归分析发现,-1271GC和-1271CC基因型与-1271GG基因型相比能提高肺癌发病风险(校正后OR分别为1.26和1.27,P值分别为0.013和0.073),且随着-1271C等位基因个数的增加,肺癌发病风险逐渐提高(Rrend=0.024)。其他2个tagSNPs位点与肺癌发病风险无明显差异(P>0.05)。我们继而在上海南京的500对肺癌病例对照人群中验证了-1271G>C多态性与肺癌发病风险的关系,多元logistic回归分析发现,在此人群中,-1271GC和-1271CC基因型与-1271GG基因型相比均能显著增加肺癌发病风险(校正后OR分别为1.44和1.65,P值分别为0.011和0.017),且有明显的等位基因剂量效应关系(Ptrend=0.004)。我们进一步分析上述3个HSPB1基因tagSNPs位点与武汉248例晚期NSCLC患者预后的关系。采用Kaplain-Meier方法分析发现,与-1271GG基因型相比,携带-1271GC和-1271CC基因型患者的中位生存期(median survival time, MST)显著延长(Log-rank P=0.004)。采用多元Cox回归模型校正年龄、性别、吸烟状态、病理学分型、TNM分期、手术治疗、化疗和放疗等因素后发现,与-1271 GG基因型相比,-1271GC和-1271CC基因型能分别降低29%和45%的患者死亡危险度(校正后HR分别为0.71和0.55,P值分别为0.045和0.012)；随着携带-1271C等位基因数目的增加,患者死亡危险度逐渐降低(Ptrend=0.007)。未发现另外2个tagSNP位点与晚期NSCLC患者预后的关系(P>0.05)。我们继而在335例南京晚期NSCLC患者人群中验证了上述结果,采用Kaplain-Meier方法分析发现,与-1271GG基因型相比,携带-1271GC基因型或-1271CC基因型患者的MST显著延长(Log-rankP=0.029)。多元Cox回归分析发现,与携带-1271GG基因型相比,携带-1271GC基因型的患者能降低27%的死亡危险度(校正后HR=0.73,P=0.029)；将-1271GC和-1271CC基因型合并后分析发现,与-1271GG基因型相比,携带-1271GC+CC基因型患者的MST明显增加(Log-rank P=0.009),死亡危险度显著降低(校正后HR=0.75,P=0.032)。本部分我们构建了中国汉族人群HSPB1基因的单体域并挑选出3个tagSNPs进行后续研究,分别在2个独立的肺癌病例对照研究人群和晚期NSCLC患者预后人群中分析发现：-1271G>C多态性的-1271C等位基因能提高中国汉族人群肺癌的发病风险、降低晚期NSCLC患者的死亡危险度。该研究结果提示HSPB1基因-1271G>C多态可能作为预测肺癌发病和预后的遗传标志物。第二部分HSPAIL-HSPAIA-HSPAIB基因簇多态性与肺癌易感性、预后的关联性研究HSPA1L-HSPA1A-HSPA1B基因簇位于人6p21.33的HLA-III区域,均编码产生诱导性的Hsp70蛋白。Hsp70蛋白在静息状态下低表达于胞浆,而在应激状态下大量表达于细胞核中,发挥对细胞内遗传物质和蛋白质的保护作用。研究发现在大多数肿瘤组织中均有Hsp70的高表达,肿瘤病人循环系统中的Hsp70抗原和抗体也可能作为肿瘤诊断和预后的重要生物学标志。本部分研究结合HapMap计划公布的此区域的中国汉族人群SNPs数据信息和本实验室前期对60例中国汉族人群HSPA1L-HSPA1A-HSPA1B基因簇的再测序结果,共同挑选出该区域的6个tagSNPs位点进行后续研究。在武汉1152对肺癌病例对照人群中进行上述位点的基因分型,多元logistic回归分析发现,以HSPA1B基因+39CC基因型为对照,+39CT和+39CT+TT基因型均能显著增加肺癌发病风险(校正后OR均为1.39,P值分别为0.013和0.010)；随着+39T等位基因个数的增加,肺癌发病风险提高(Ptrend=0.026)。HSPA1B基因-912C>T和+39C>T多态位于同一个单体域中。对该基因的单体型结果发现,携带-912T-+39T单体型个体与携带-912C-+39C单体型个体比较,肺癌发病风险明显增加(校正后OR=1.37,P=0.008)。未发现其他5个tagSNPs位点(HSPA L_+2763C>T、HSPA1L_+2437A>G、HSPA1A_-110A>C、HSPA1A_+190G>C、及HSPA1B_-912C>T位点)与肺癌发病风险的关系(P>0.05)。我们继而在北京1000对肺癌病例对照人群中验证了HSPA1B基因+39C>T多态性与肺癌发病风险的关系,多元logistic回归分析发现,以HSPA1B基因+39CC基因型为对照,+39CT和+39CT+TT基因型均能显著增加肺癌发病风险(校正后OR分别为1.30和1.28,P值分别为0.038和0.048)。我们进一步研究了上述6个tagSNPs位点与武汉281例晚期NSCLC患者预后的关系,采用Kaplain-Meier方法分析发现,与HSPA1B基因-912CC基因型相比,携带-912CT或-912TT基因型患者的MST显著缩短(Log-rank P=0.005);与HSPA1B基因+39CC基因型相比,携带+39CT基因型患者的MST显著缩短(Log-rankP=0.028)。多元Cox回归分析发现,与-912CC基因型相比,-912CT和-912TT基因型能分别增加62%和92%的患者死亡危险度(校正后HR分别为1.62和1.92,P值分别问0.001和0.017)；与+39CC基因型相比,携带+39CT+TT基因型能临界增加51%的患者死亡危险度(校正后HR=1.51,P=0.066)。对HSPA1B基因单体型和单体型对的分析结果发现,以-912C-+39C单体型为参照,携带-912C-+39T单体型的晚期NSCLC患者的死亡危险度险明显增加(校正后HR=1.51,P=5.9x10-4)；以CC／CC单体型对为参照,携带CC/TC和CC/TT单体型的晚期NSCLC患者的死亡危险度明显增加(校正后HR分别为1.57、1.78,校正后P分别为0.004、0.033)。本部分我们挑选了HSPA1L-HSPAIA-HSPA1B基因簇的6个tagSNPs,分别在两个独立肺癌病例对照研究人群分析发现,HSPA1B基因+39C>T位点的+39T等位基因能提高肺癌发病风险。HSPA1B基因启动子区-912T等位基因和HSPA1B基因5’UTR区+39T等位基因还能增加晚期NSCLC患者的死亡危险度,此结果还需要在另一独立晚期NSCLC患者中进行验证,并分析此2个多态性位点的生物学功能。第三部分BCL2、BAG1、APEX1基因多态性与肺癌易感性、预后的关联性研究Hsp70主要通过与细胞内多种蛋白质结合而发挥细胞保护作用。BAG-1(Bcl-2-associated athanogene 1, Bcl-2关联永生蛋白1)是细胞内重要的凋亡抑制蛋白,其可以作为共伴侣(co-chaperone)结合在Hsp70蛋白的N端,并促进Hsp70蛋白的C端底物结合区与相应蛋白如Bcl-2对结合。Bcl-2也是细胞内重要的凋亡抑制蛋白,BAG-1可结合Bcl-2蛋白并增强其抑制凋亡的作用。上述三种蛋白(Hsp70、Bcl-2和BAG-1)相互作用,共同发挥抗凋亡的作用。此外,Hsp70还可与DNA修复蛋白HAP-1 (Human AP endonuclease 1,人无嘌呤无嘧啶核酸内切酶)相互作用增强其核酸内切酶活性。本部分根据HapMap数据库公布的中国汉族人群SNPs数据信息选择与Hsp70相互作用的BCL2、BAG1、APEX1基因功能区域的tagSNPs位点进行研究。在武汉1152对肺癌病例对照人群中分析发现,以BCL2基因+21AA基因型为对照,+21AG和+21AG+GG基因型能显著降低肺癌发病风险(校正后OR分别为0.76和0.77,P值分别为0.025和0.027)；随着+21G等位基因个数的增加,肺癌发病风险逐渐降低(Ptrend=0.039)。以BCL2基因c.*1204GG基因型为对照,c.*1204GA和AA基因型均能临界降低肺癌发病风险(校正后OR分别为0.83和0.79,P值分别为0.050和0.087),携带c.*1204GA+AA基因型个体肺癌的发病风险显著降低(校正后OR=0.82,P=0.029)；随着c.*1204A等位基因个数的增加,肺癌发病风险逐渐降低(Ptrend=0.035)。未发现其他4个SNPs位点(如BCL2基因-938C／A位点、BAG1基因c.车1612G／C位点、APEX1基因Ile64Val和Asp148Glu位点)与肺癌发病风险的关系。将HSPA1B基因+39C>T位点与BCL2基因+21A>G、c.*1204G>A位点联合分析发现,随着携带危险性基因型数目的增多,肺癌的发病风险逐渐增加(Ptrend<0.001)。我们进一步研究了上述三个基因的tagSNPs位点与武汉281例晚期NSCLC患者预后的关系,采用Kaplain-Meier方法分析发现,与BCL2基因c.*1204GG基因型相比,携带c.*1204GA或AA基因型患者的MST显著延长(Log-rank P=0.027)。采用多元Cox回归分析发现,与携带c.*1204GG基因型相比,c.*1204GA和c.*1204AA基因型能分别降低31%和33%的患者死亡危险度(校正后HR分别为0.69和0.67,P值分别为0.013和0.068)；随着携带c.*1204A等位基因数目的增加,患者死亡危险度逐渐降低(Ptrend=0.018)。将HSPA1B基因-912C>T和+39C>T位点与BCL2基因c.*1204G>A位点联合分析发现,随着携带危险性基因型数目的增多,晚期NSCLC患者的MST逐渐减少(Log-rank P<0.001),死亡危险度逐渐增加(Ptrend<0.001)。本部分结果提示BCL2基因+21A>G多态的+21G等位基因和c.*1204G>A多态的c.*1204A等位基因能减低肺癌的发病风险,后者还能延长晚期NSCLC患者的MST,减低其死亡危险度。HSPA1B与BCL2基因阳性位点在提高肺癌发病风险和晚期NSCLC患者死亡危险度方面具有联合作用。本部分的人群结果还有待于在更大样本的独立人群中进行验证,并利用体内外生物学实验中分析阳性位点的功能。第四部分HSPB1、HSPA1B、BCL2基因阳性SNPs位点与PAHs所致的DNA损伤的关联性研究炼焦过程中产生的焦炉逸散物中含有大量致癌性PAHs,可导致机体的DNA损伤,后者是肿瘤发生的早期生物学事件,也是职业性焦炉工肺癌发病的主要原因。由于时间的限制,本课题组尚未收集到足够的焦炉工肺癌人群,但对这一特定职业PAHs暴露人群的遗传背景和外周血DNA损伤程度进行检测,将作为一个良好的反映“基因型-表型”关系的分析模型。本部分研究共收集了某焦化厂309例工人,其中包括207例直接暴露于焦炉逸散物至少半年以上的焦炉作业工人(暴露组)和102无职业PAHs暴露的工人(对照组),采用血浆BPDE-白蛋白加合物水平作为内暴露水平对所有人群的环境暴露剂量进行校正。对本研究前三部分中发现的阳性SNPs位点(HSPB1基因-1271G>C、HSPA1B基因-912C>T和+39C>T、BCL2基因+21A>G和c.*1204G／A位点)进行基因分析,探讨与机体DNA损伤程度的关系。研究发现,焦炉作业工人外周血淋巴细胞Olive尾矩(Olive Tail Moment, OTM) (1.22±1.10)显著高于对照组(0.60±0.92)(P<0.001)；多元协方差分析校正年龄、工龄、吸烟和BPDE白蛋白加合物水平后发现,在暴露组中,与携带HSPB1基因-1271GG基因型相比,携带-1271GC、-1271CC、-1271GC+CC基因型的职业焦炉作业人群的OTM值明显增加(校正后P值分别为0.033、0.061、0.027)；随着携带-1271C等位基因数目的增加,暴露组个体外周血淋巴细胞OTM值逐渐增加(Ptrend=0.031)。随着携带HSPA1B基因-912T等位基因数目的增加,对照组个体外周血淋巴细胞OTM值逐渐增加(Ptrend=0.038)。未发现HSPA1B基因-912C>T和+39C>T位点及BCL2基因+21A>G和c.*1204G>A位点各基因型与暴露组和对照组外周血淋巴细胞OTM值的关系(P值均>0.05)。本部分的研究结果提示,在机体受到外源性有害物质(如PAHs暴露)时,携带HSPB1基因-1271C等位基因个体的DNA损伤程度明显增加,DNA修复能力降低。结合第一部分的结果可以推测这可能是-1271C等位基因增加肺癌发病风险的重要原因,还可能是使携带-1271C等位基因的晚期NSCLC肿瘤患者提高了对放化疗的敏感性及其预后的重要原因。第五部分HSPB1、HSPA1B基因调节区阳性SNPs位点的功能研究位于基因翻译起始点上游含有启动子区和5’端非翻译区(5’untranslated region,5’UTR),前者的DNA转录元件可以和相应的转录因子结合而启动基因的转录,后者的二级结构具有维持mRNA稳定性的作用。因此,位于这2个区域的SNPs位点可能通过影响上述调节机制而改变基因的表达水平。本部分主要对第一部分研究发现的位于HSPB1基因启动子区-1271G>C位点和第二部分发现的位于HSPA1B基因启动子区-912C>T位点和5’UTR区+39C>T位点对相应蛋白表达水平的影响进行功能研究。我们采用报告基因试验检测了上述三个位点对报告基因荧光素酶活性的影响,采用Western blotting方法检测了-1271G>C基因型对肺癌患者肺癌组织及癌旁组织中Hsp27蛋白表达的影响。结果发现在16HBE、H446、A549和HepG2四种细胞株中,含-1271C等位基因的HSPB1基因启动子驱动的荧光素酶活性均明显低于含-1271G等位基因的HSPB1基因启动子(P值均<0.05)。Western blotting检测发现Hsp27蛋白在肺癌组织的表达量明显高于在癌旁组织中的表达；在肺癌组织中,携带上述三种不同-1271G>C基因型个体的Hsp27蛋白表达没有显著性差异；在癌旁组织中,携带-1271CC基因型个体的Hsp27蛋白表达临界低于携带-1271GG基因型个体(P=0.057)。将含4种不同HSPA1B基因-912C>T、+39C>T位点组成的单体型(即-912C-+39C、-912C-+39T、-912T-+39C、-912T-+39T单体型)的报告基因质粒转染16HBE、A549和HepG2三种细胞株后发现,-912C-+39T、-912T-+39C、-912T-+39T单体型驱动的驱动的荧光素酶活性均明显低于含-912C-+39C单体型的报告基因质粒(P均<0.05)；-912T-+39T单体型驱动的荧光素酶活性均明显低于含-912C-+39T、-912T-+39C单体型的报告基因质粒(P均<0.05)；-912T-+39C单体型驱动的荧光素酶活性均明显低于含-912C-+39C单体型的报告基因质粒(P均<0.05)；含-912C-+39T、-912T-+39C单体型的报告基因质粒驱动的荧光素酶活性无显著性差异(P均>0.05)。荧光素酶活性高低依次为：-912C-+39C>-912C-+39T=-912T-+39C>-912T-+39T。将只含有HSPA1B基因+39C>T多态性位点(分别携带+39C和+39T等位基因)的报告基因质粒转染上述三种细胞株后发现,携带+39T等位基因驱动的荧光素酶活性均明显低于+39C等位基因(P均<0.05)。本部分的结果提示含-1271C等位基因的HSPB1基因启动子驱动的荧光素酶的表达和活性明显降低,且在癌旁组织中,携带-1271CC基因型个体的Hsp27蛋白表达临界低于携带-1271GG基因型个体；含-912T和+39T等位基因的HSPA1B基因启动子驱动的荧光素酶的表达和活性明显降低。综上所述,本论文以肺癌病例对照人群和晚期NSCLC患者为研究对象,探讨HSPB1基因(表达Hsp27蛋白)和HSPA1L-HSPA1A-HSPA1B基因簇(表达Hsp70蛋白)及Hsp70相互作用基因(BCL2、BAG1、APEX1)的tagSNPs位点与肺癌发病风险和晚期NSCLC患者预后的关系；进一步从基因型-表型上分析了阳性位点与焦炉工DNA损伤的关系,并对HSPB1和HSPA1B基因5’端调节区阳性SNPs进行功能实验,探索了阳性位点对目基因表达的影响。本研究的创新之处在于：(1)首次发现HSPB1及HSPA1B基因多态性对肺癌发病和预后的影响(2)从肺癌的早期生物学效应(DNA损伤)、肺癌发生、肺癌预后三个方面出发,比较完整的阐明功能性SNPs的作用；(3)在多中心的独立样本中验证了流行病学研究的结果；(4)将职业性PAHs暴露的焦炉作业工人的遗传背景和DNA损伤水平联系起来,建立了一个良好的反映基因-环境相互作用的“基因型-表型”研究模型。本研究的不足之处及有待深入研究的地方：(1)本研究发现HSPA1B和BCL2基因多态性均与肺癌发病风险和预后有关,此结果还需要在其他人群中进行验证,对HSPA1B和BCL2位点的生物学功能和基因-基因相互作用的机制还有待于进一步研究和证实；(2)本研究还需要进一步研究焦炉逸散物致焦炉工DNA损伤的生物学机制和作用靶点,为焦炉工人的个体防护措施提供依据；(3)从DNA损伤到肺癌的发生是一个复杂的过程,本研究中的肺癌样本并不能代表焦炉工肺癌,因此,需进一步采用队列研究证实研究影响焦炉工肺癌易感性的环境和遗传生物学标志,为职业人群筛检方法的建立和肺癌发生发展机制的进一步阐明提供科学依据。