背景:胃癌作为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,具有很高的致死率。中国是胃癌的高发地区。早期胃癌患者缺乏特异性的临床症状和影像学特征,常常被误诊。当出现明显症状时,大多处于进展期。尽管现在的诊疗技术进一步发展,进展期的胃癌病人预后仍然非常差。除了肿瘤本身的异常增殖,浸润和转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的浸润及转移涉及多个步骤、多种因素,牵涉很多机制和基因。此过程包括肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与细胞外基质之间相互作用。最早的转移机制是由Liotta提出的,包括三个步骤:粘附、降解和移动。在肿瘤浸润转移过程中,上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)发挥重要的作用。EMT涉及多种标记物表达的变化。钙粘附蛋白是一类常见的粘附分子,它是一类依赖钙离子的跨膜糖蛋白。可以介导正常组织和肿瘤组织中细胞-细胞间的粘附及连接作用。钙粘附蛋白家族包括经典钙粘蛋白(classic cadherins)、桥粒钙粘蛋白(desmosomal cadherins)、Flamingo(CELSR)钙粘蛋白,FAT钙粘蛋白(fat-like cadherins)和原钙粘蛋白(protocadherins,PCDH)。原钙粘蛋白是最大的钙粘蛋白超家族,最早由Shintaro发现并命名。PCDH是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白,根据基因结构和功能可将其分为:非成簇原钙粘蛋白(Nonclustered PCDH)、成簇原钙粘蛋白(Clustered PCDH)。PCDH7属于非成簇PCDH家族,位于人染色体4p15。PCDH7首先是在胃癌细胞中被发现的,后来研究发现其主要在人类和鼠的脑和心脏中表达。PCDH7作为粘附分子也具有粘附能力,只不过作用要小一点。目前的研究主要表明,PCDH7可以影响神经系统发育,并且在多种肿瘤中存在异常表达,然而其在肿瘤中的异常表达和发挥作用的机制尚不清楚。本实验的主要目的,检测PCDH7在胃癌组织及胃粘膜组织中是否存在差异表达。并进一步分析PCDH7的表达和胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系,明确PCDH7对胃癌细胞增殖、浸润和迁移能力的影响,并探索PCDH7参与胃癌细胞浸润转移的相关调节机制。方法:收取山东大学齐鲁医院病理科47例胃腺癌和25例正常胃粘膜新鲜组织,并完善其临床资料。所有标本均经过病理确诊。提取标本的RNA,反转录,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测两组标本中PCDH7mRNA的表达。回顾性分析2004年1月至2007年5月间保存的119例胃腺癌及75例胃粘膜石蜡标本,所有标本均有完善的临床病例资料。采用免疫组化方法,检测PCDH7蛋白在胃癌、上皮内瘤变及正常胃粘膜之间的差异。分析PCDH7蛋白与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤体积、分型、TNM分期、淋巴结转移以及远处转移等病理参数的关系,明确其对胃癌的影响。对119例胃癌病人均进行随访,确定患者的基本情况。根据相关数据,采用Kaplan-Meier生存法,分析PCDH7与总生存期(overall survival,OS)、无瘤生存期(disease-free survival,DFS)的关系,明确PCDH7对胃癌患者预后的影响。进一步采取了单因素和多因素方法分析,明确PCDH7是否为胃癌患者预后的独立因素。为进一步确定PCDH7对胃癌的影响,进行细胞功能学方面的实验。常规培养胃癌细胞株BGC 823和MKN 45。采用瞬时转染siPCDH7,抑制胃癌细胞内PCDH7的表达。提取RNA,反转录,RT-qPCR,检测转染效率。转染siPCDH7后,MTS法检测胃癌细胞株BGC 823和MKN 45增殖能力的变化。采用Transwell小室法,进行人工重组基底膜侵袭、迁移实验,检测PCDH7对胃癌细胞株BGC 823和MKN 45侵袭、迁移能力的影响。为研究PCDH7在胃癌中的作用机制,采取RT-qPCR检测EMT相关因子E-cadherin,N-cadherin,β-catenin,Vimentin,Twist,Snail,Zeb1 和 Zeb2 等 mRNA水平的变化。并进一步采用 Western blot 检测 E-cadherin,β-catenin,Vimentin 和Snail蛋白水平的表达变化。结果:1.胃癌组织中PCDH7表达降低首先,检测标本中PCDH7mRNA的含量。显示,与正常胃粘膜相比,胃癌组织中PCDH7mRNA明显降低,比起正常胃组织下调17.8倍。免疫组化结果,胃粘膜中PCDH7蛋白的阳性表达率为(20/20,100%),上皮内瘤变组织为63.6%(35/55),胃癌组织为32.8%(39/119)。总之,从正常胃粘膜、上皮内瘤变到胃癌组织,PCDH7蛋白表达水平呈现渐进式降低,组别间的差异均具有统计学意义(组间P<0.001)。此外,与没有淋巴结转移的胃癌相比,存在淋巴结转移者PCDH7的表达率明显降低(P<0.001)。结果提示,PCDH7在胃癌的淋巴结转移中可能起重要作用。我们应用 ROC(receiver operator characteristic)曲线评价 PCDH7 在诊断胃癌与非癌组织中的价值。结果显示,ROC曲线能很好的区分两者,胃癌和非癌变组织之间,曲线下的面积(area under the curve,AUC)为0.938,表明PCDH7的表达可以用来区分两者。另外,ROC曲线表明,PCDH7的表达可以用来区别胃癌淋巴结转移与否(AUC=0.695,P=0.01)。2.PCDH7的表达与临床病理参数之间的关系胃癌标本PCDH7的低表达水平与Lauren’s分型(P=0.0005)呈正相关,肠型胃癌(55.3%)显著高于弥漫型胃癌(26.2%);无淋巴结转移组(55.3%)显著高于淋巴结转移组(22.2%)(P=0.0002);与TNM分期(P=0.0221)呈正相关,Ⅰ期阳性率为50%(12/24),Ⅱ-Ⅳ期阳性率为28.4%(27/95)。而PCDH7蛋白的表达与肿瘤患者的年龄、性别、肿瘤体积以及是否存在远处器官转移等参数无明显相关性。这些数据显示PCDH7参与胃癌的发生、发展。3.PCDH7的表达与预后的关系Kaplan-Meier生存分析显示,PCDH7高表达患者的术后生存时间(P =0.0490)、无瘤生存时间(P = 0.0380)明显高于PCDH7低表达的患者。单因素分析结果显示,PCDH7的表达、癌组织浸润深度、淋巴结转移、远处脏器转移和肿瘤分期是胃癌预后的因素。多因素分析显示,远处转移、肿瘤分期是独立的预后影响因素,而PCDH7并不是胃癌患者独立的预后因素。4.细胞学功能实验结果MTS法检测胃癌细胞的增殖能力。结果显示,抑制PCDH7的表达后,BGC 823和MKN 45细胞的增殖能力无明显变化。侵袭和迁移实验中,采用直接计数法,计数穿透小室的细胞数。PCDH7抑制后,穿透Transwell底部的膜,进入下层的BGC 823及MKN 45细胞数,均比对照组的多(P<0.05)。细胞功能学实验,更加明确PCDH7可以抑制胃癌细胞的迁移和浸润。5.干扰PCDH7的表达对EMT相关分子表达的影响RT-qPCR结果显示,干扰PCDH7的表达后,在两株胃癌细胞中EMT相关因子中只有 E-cadherin 的 mRNA 水平降低,而 N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Twist、Snail、Zeb1和Zeb2等分子无明显变化。Western blot结果表明,随着PCDH7表达降低,在两株胃癌细胞株中,E-cadherin蛋白表达水平均降低。PCDH7的表达E-cadherin呈正相关。其他EMT相关蛋白β-catenin、Vimentin和Snail等无显著变化,PCDH7的低表达与其无关。结论:1.PCDH7在胃癌组织中低表达,抑制胃癌的浸润转移,与胃癌的预后有关。2.PCDH7通过调节E-cadherin的表达抑制胃癌的浸润和转移。3.PCDH7可以作为胃癌诊断和预后判断的新的指标。