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颅脑外伤的致死致残率非常高,除机械打击引起的原发性损伤外,继发性损伤引起的迟发性脑损伤和细胞死亡,包括凋亡和自噬性细胞死亡亦为颅脑损伤高致死致残率的重要病理基础。颅脑外伤后细胞凋亡通路及发生过程已较为清楚。但自噬在颅脑外伤中的作用还不甚明确。大量的动物实验和临床研究表明亚低温具有脑保护作用,能够减轻颅脑损伤后脑组织的病理损伤程度,减少神经细胞凋亡,促进神经功能康复,但是其保护机制,尤其是自噬在其中的作用仍未完全阐明。本课题采用大鼠液压冲击脑损伤常温及亚低温模型探明颅脑外伤之后神经细胞的凋亡和自噬的变化规律,以及亚低温对此类迟发性细胞损伤的影响,试图从不同的神经细胞死亡方式及其相互作用方面探讨亚低温对脑外伤继发性病理损害的保护机制。本研究共分为三个部分。第一部分:大鼠液压冲击颅脑损伤常温及亚低温模型的建立和评价;第二部分:亚低温对脑外伤后大脑皮层和海马CA1区细胞凋亡、自噬相关蛋白的影响;第三部分:调控亚低温后自噬的表达对颅脑损伤后大鼠运动和记忆功能的影响。第一部分大鼠液压冲击颅脑损伤常温及亚低温模型的建立和评价目的:建立稳定可重复的大鼠液压冲击颅脑损伤常温及亚低温模型,从组织病理学及神经行为学,包括运动和认知功能两方面对模型质量进行评估,为深入开展创伤性颅脑外伤的相关动物实验奠定基础。方法:雄性SD大鼠72只,随机分为假损伤常温组(18只),假损伤亚低温组(18只),脑损伤常温组(18只),脑损伤亚低温组(18只)。颅脑损伤使用颅脑液压打击仪完成;亚低温(32.5±0.5℃)使用冰浴降温完成,亚低温结束后1小时内缓慢复温至37±0.3℃。假损伤常温组大鼠仅做致伤准备而不进行打击及亚低温处理(体温保持在37±0.3℃);假损伤亚低温组大鼠致伤后给予亚低温处理;损伤常温组大鼠仅致伤不降温(体温保持在37±0.3℃);损伤亚低温组大鼠致伤及亚低温处理。所有试验动物在损伤前后均监测生理参数及神经反射功能。每组各3只分别于致伤后6h及24h处死后观察大体形态及病理改变(H&E染色)。另外各组各取6只大鼠分别通过行走实验及水迷宫实验来检测运动功能及认知功能改变。结果:除脑温及肛温在亚低温组有明显差异外,所有生理参数均在正常范围内波动且各组之间无统计学差异。大体观可见假损伤组及假损伤亚低温组未见明显大脑皮层异常改变,而在损伤常温组及亚低温组均可以看到明显大脑皮层异常改变,但在亚低温组大脑皮层损伤程度较轻;HE染色可见显示亚低温组大鼠致伤灶周围皮层和海马损伤程度较常温组大鼠为轻。行为学检测显示亚低温能够明显改善大鼠的运动功能和认知功能。结论:该部分实验成功建立了组织病理学及神经行为学表现接近临床中度颅脑损伤的动物模型,为我们下一步研究亚低温的脑保护作用提供了良好条件。第二部分亚低温对脑外伤后大脑皮层及海马CA1区细胞凋亡、自噬相关蛋白的影响目的:探讨中度液压颅脑外伤及亚低温干预对大脑皮层及海马CA1区神经元凋亡及自噬的变化。方法:采用前期成功制作的大鼠液压冲击伤常温及亚低温模型,108只大鼠采用随机数字法随机分三组:假损伤常温组,脑损伤常温组,脑损伤亚低温组。在致伤后6h和24h处死大鼠。运用TUNEL染色分析大脑皮层及海马CA1区神经细胞死亡指数的变化,同时使用免疫荧光技术和Western-blot技术对凋亡相关蛋白caspase-3及自噬相关蛋白,包括LC-3及Beclin-1进行测定,并使用免疫荧光双标技术对自噬的表达进行细胞定位,同时使用电镜对自噬体的数量进行观察。结果:假损伤常温组大鼠未见明显神经元凋亡及自噬性改变。致伤后6h及24h TUNEL结果显示液压颅脑损伤能够引起损伤大脑皮层及海马CA1区明显的细胞凋亡指数增加,而亚低温能够抑制细胞凋亡;使用Western-blot技术检测损伤大脑皮层及海马CA1区凋亡相关蛋白caspase-3,结果显示凋亡相关蛋白caspase-3在脑外伤之后明显上调,而亚低温能够抑制其上调;使用免疫荧光技术及Westernblot技术检测损伤大脑皮层及海马CA1区自噬相关蛋白LC3及Beclin-1,结果显示LC3及Beclin-1在外伤后明显上调,而亚低温之后此种上调趋势更加明显;电镜显示自噬体的数目在颅脑外伤之后明显增加,而亚低温之后增加更为明显。细胞定位显示自噬相关蛋白LC3及Beclin-1在神经元及神经胶质细胞上均有表达。结论:大鼠中度液压损伤后损伤周围区域皮层及海马CA1区凋亡增加,自噬亦同时增加;亚低温干预能够明显减少皮层及海马区域内神经细胞凋亡,同时能够增加自噬相关蛋白的表达。第三部分调控亚低温后自噬的表达对颅脑损伤后大鼠运动和记忆功能的影响目的:研究大鼠脑室内注射自噬抑制剂3-MA对亚低温干预后的损伤大脑皮层及海马CA1区自噬及凋亡的影响以及神经功能变化情况。方法:建立大鼠脑外伤亚低温模型,63只大鼠采用随机数字法分为三组:脑外伤亚低温组,脑外伤亚低温组+脑室内注射人工脑脊液组,脑外伤亚低温组+脑室内注射3-MA组。使用免疫荧光技术及Western-blot技术观察caspase-3,LC3,Beclin-1,Bcl-2及Bax的蛋白表达变化;使用电镜观察自噬体数目的变化;使用行走实验及水迷宫实验观察大鼠行为学变化。结果:使用免疫荧光及Western-blot技术发现致伤前脑室内注射3-MA能够使损伤大脑皮层及海马CA1区LC3,Beclin-1及Bcl-2蛋白表达水平明显降低而Bax蛋白表达水平则明显升高;Beclin-1/Bcl-2比值则明显降低,Bcl-2/Bax比值则降低;电镜显示自噬体数目明显降低;水迷宫及行走实验提示脑室内注入3-MA能显著增加大鼠的神经行为学功能障碍;致伤前脑室内注射3-MA能够明显上调大脑皮层及海马区域细胞凋亡指数。结论:自噬增加可能为亚低温脑保护机制之一;其可能的机制是自噬对凋亡的负性调节作用。