水稻新基因OsAAA1的功能初步研究

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在植物防御病原菌入侵的反应过程中,涉及到植物超敏反应、病原菌应答基因诱导表达、多种激素信号传导等反应。其中SA介导的信号途径发挥重要作用。在前期的研究中,利用基因芯片发现AAA-ATPase基因家族一个新成员OsAAA1在SA信号途径中起正调控作用。AAA基因超家族含有一个保守的ATPase核心结构域和一个α螺旋,AAA超级家族C端结构域在ATP水解、形成寡聚体、结合辅助因子过程中起重要调节作用。其核心结构域包含了保守的Walker A和Walker B序列,一个高度保守的同源次生结构域(SHR)。其中Walker A和Walker B分别是ATP结合、催化所必须,同时也用于指导ATP中β-和γ-Pi与Mg的结合。本文对OsAAA1的功能进行了初步研究,主要内容包括如下4个方面:  1)利用农杆菌介导的遗传转化将OsAAA1 RNAi重组载体转入日本晴(NB)愈伤组织中,经过共培养、筛选、分化、生根培养得到转基因苗。经过PCR阳性鉴定共得到55株成功插入OsAAA1 RNAi双链的T0代植株,进一步对T1代植株进行RNA表达水平的鉴定,目前得到6株表达量明显下调的T1代植株,并收获T2代种子。表型鉴定正在进行中。  2)将融合上GFP的目的基因转化水稻黄化苗原生质体中,同时也将目的基因分别和标准蛋白,包括膜定位蛋白、液泡膜定位蛋白、核定位蛋白共转化原生质体。在激光共聚焦显微镜下观察目的基因的绿色荧光,液泡膜定位蛋白、膜定位蛋白的红色荧光,根据各个实验的定位结果,初步判定目的蛋白OsAAA1定位于细胞核与细胞质中。  3)构建pET-32a-OsAAA1蛋白表达载体,摸索蛋白最优表达条件,纯化可溶性目的蛋白,然后进行ATPase酶活测定。经Ni柱纯化蛋白,Western blotting进一步检测表明目的蛋白得到表达纯化,并且单一性较好。将纯化蛋白进行ATPase酶活检测,得到的酶活含量很低,不能用于计算。目前正在着力解决这一问题。  4)成功构建稻瘟病菌诱导型启动子重组载体PPR1b-ADH-OsAAA1,用于后续水稻遗传转化,为OsAAA1基因的育种学运用奠定基础。
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