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背景梓醇是从中药地黄中分离出的主要有效成分之一,可治疗脑缺血、糖尿病性脑病、帕金森病、痴呆等神经系统疾病。前期研究表明,梓醇对脑缺血大鼠具有神经保护作用,能有效促进脑缺血后的神经功能恢复,是缺血性脑卒中的潜在治疗剂。梓醇在正常胃肠环境下易被破坏,致使口服剂量是静脉给药剂量的数倍,因此寻找能够提高梓醇吸收的给药途径对于梓醇的应用和开发具有重要意义。鼻腔给药可绕过血脑屏障,避免肝脏首过效应,具有吸收迅速、起效快,可明显提高药物的生物利用度,其使用方便的特点适用于院外急救和自救。脑卒中是常见的神经系统疾病,脑卒中可分为缺血性卒中和出血性卒中,其中85%以上为缺血性卒中。脑缺血发作急迫,不可预测,急性期尽早快速用药是影响治疗的关键。rt-PA是唯一得到公认治疗脑卒中的有效药物,但rt-PA价格昂贵且治疗时间窗狭窄,只有少数患者可以受益于治疗恢复脑血流。且脑缺血后会常见意识障碍和吞咽困难,口服药物有引起窒息的危险。梓醇作为缺血性卒中的潜在保护剂,如果能够经鼻腔给药后及时到达病灶部位,保护缺血及其周围区缺血脑组织,将会为挽救中风患者带来机会。目的本论文采用梓醇滴鼻液直接滴入鼻腔的方法,无损伤性的将梓醇导入脑部,比较与灌胃给药和静脉给药的优势,探究梓醇鼻腔给药对脑缺血大鼠的神经功能恢复和神经保护作用以及通过介导Nrf2/HO-1和Bcl-2/Bax改善体内外氧化应激凋亡损伤,为梓醇鼻腔给药防治脑缺血提供实验依据。方法1、梓醇的不同给药方式抗脑缺血作用比较将试验小鼠随机分成5组:正常组、静脉注射组（i.v.10mg/kg）、灌胃组（i.g.10mg/kg）、鼻腔给药低剂量组（i.n.2.5mg/kg）、鼻腔给药中剂量组（i.n.5mg/kg）、鼻腔给药高剂量组（i.n.10mg/kg）。采用不同的动物模型,分别观察梓醇不同给药方式对小鼠出血时间、凝血时间、全脑缺血后存活时间的影响、抗常压缺氧作用和小鼠实验性脑血栓形成的影晌。2、梓醇滴鼻液对脑缺血大鼠神经保护效应用线栓法制备脑缺血模型,实验动物随机分为分为假手术组、模型组、鼻腔给药低剂量组（i.n.2.5mg/kg）、鼻腔给药中剂量组（i.n.5mg/kg）、鼻腔给药高剂量组（i.n.10mg/kg）。在给药后对各组实验大鼠进行各项行为学评价,评测梓醇给药后脑缺血大鼠相应时点的神经功能恢复情况。用TTC染色评价大鼠模型梗死体积的情况,结合脑含水量评价脑水肿,采用HE染色观察大鼠缺血脑组织病理学损伤情况。3、梓醇滴鼻液对脑缺血大鼠氧化应激凋亡损伤的影响用TUNEL染色检测大鼠缺血脑区细胞凋亡,生化法检测氧化应激相关指标SOD、MDA的含量,Western blot技术检测氧化应激凋亡损伤相关蛋白Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1的表达。使用Discovery Studio 3.5进行梓醇和蛋白之间的分子对接分析。4、体外探究梓醇对细胞氧糖剥夺损伤的影响体外培养PC12细胞,采用缺糖缺氧的方法建立PC12氧糖剥夺损伤（OGD）模型。采用MTT法检测细胞存活率,生化法检测氧化应激相关指标SOD、MDA的含量,Western blot技术检测氧化应激凋亡损伤相关蛋白Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1的表达,细胞免疫荧光法检测梓醇对氧糖剥夺后PC12细胞中Nrf2蛋白核转位情况。结果1、梓醇的不同给药方式抗脑缺血作用比较梓醇鼻腔给药极显著性增加出血时间和凝血时间（P＜0.01）,具有较强的活血作用,且鼻腔给药的效果大于静脉注射和灌胃。研究发现梓醇对小鼠脑缺氧缺血具有保护作用,梓醇鼻腔给药在小鼠常压缺氧以及全脑缺血下可以明显延长小鼠的存活时间（P＜0.01）,表明鼻腔给药能更大程度发挥梓醇的抗缺氧损伤作用以及实验性脑血栓形成后的偏瘫恢复率。2、梓醇滴鼻液对脑缺血大鼠神经保护效应线栓法成功制备脑缺血模型,行为学实验结果表明,梓醇鼻腔给药组不同程度改善脑缺血大鼠Bederson评分、m NSS神经功能缺损评分和肌力测试。TTC结果表明梓醇鼻腔给药治疗后可显著减轻脑梗死体积（P＜0.01）。梓醇鼻腔给药显著性减轻了MCAO所致的脑水肿,显著降低含水量（P＜0.05）。HE结果显示梓醇鼻腔给药在一定程度上逆转了病理改变,减轻神经细胞水肿,炎性细胞浸润和核染加深细胞数显著减少（P＜0.01）,海马CA1区排列规整,说明梓醇鼻腔给药对缺血脑区细胞损伤有保护作用。3、梓醇滴鼻液对脑缺血大鼠氧化应激凋亡损伤的影响TUNEL染色结果显示梓醇鼻腔给药均可极显著减少红色TUNEL染色阳性细胞数,降低梗死区细胞凋亡（P＜0.01）。Western blot结果显示,梓醇鼻腔给药10mg/kg组极显著性增加抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达（P＜0.01）,显著性减少促凋亡蛋白Bax的表达（P＜0.05）,并且极显著性增加Bcl-2/Bax的比值（P＜0.01）。生化法检测氧化应激相关指标结果发现,MCAO损伤后SOD含量减少MDA含量增加,梓醇鼻腔给药2.5mg/kg、10mg/kg组可显著性增加SOD的含量表达（P＜0.05）,梓醇鼻腔给药均可显著性减少MDA的含量表达（P＜0.05）。Western blot检测氧化应激相关蛋白结果表明梓醇鼻腔给药2.5mg/kg组可显著性增加Nrf2蛋白的表达（P＜0.05）,5mg/kg组可极显著性增加Nrf2蛋白的表达（P＜0.01）,梓醇鼻腔给药2.5mg/kg,5mg/kg组可极显著性上调HO-1蛋白的表达（P＜0.01）。这些结果表明梓醇鼻腔给药能显著减轻脑缺血诱导的氧化应激凋亡损伤。分子对接分析结果表明,梓醇主要通过氢键结合与Nrf2,HO-1,Bcl-2,BAX蛋白结合。4、体外探究梓醇对细胞氧糖剥夺损伤的影响MTT结果显示梓醇10μM可极显著差异增加PC12细胞的存活率（P＜0.01）,OGD后,细胞的存活率随着时间的增加而降低,4h的时候死亡率为40%左右。与正常组相比,OGD组细胞存活率显著性降低（P＜0.01）,梓醇可显著性增加OGD后PC12细胞的存活率（P＜0.01）。Western blot结果表明梓醇可显著性增加PC12细胞OGD损伤后抑凋亡蛋白Bcl-2的表达（P＜0.05）,减少促凋亡蛋Bax蛋白的表达（P＜0.01）并且极显著性增加Bcl-2/Bax的比值（P＜0.01）。生化法检测氧化应激相关指标结果表明,梓醇可极显著性增加PC12细胞SOD的含量表达（P＜0.01）,显著性减少MDA的含量表达（P＜0.05）。Western blot结果表明梓醇可显著性增加细胞中氧化应激相关蛋白Nrf2和HO-1蛋白的表达（P＜0.05）。细胞免疫荧光法检测Nrf2蛋白核转位结果表明OGD增加了Nrf2核转位细胞数（P＜0.05）;梓醇可极显著性增加Nrf2核转位细胞数（P＜0.01）,说明梓醇可增加OGD后的Nrf2核转位现象。结论鼻腔给药与其他给药方式相比,可以增强抗脑缺血作用。梓醇鼻腔给药能有效保护急性期脑缺血大鼠的脑损伤,改善神经功能障碍,为脑缺血急性期给药提供了可能。梓醇鼻腔给药的神经保护作用涉及氧化应激途径Nrf2/HO-1和凋亡途径Bcl-2/Bax的激活。本研究为梓醇的后期开发给药途径选择提供前期实验依据,有助于梓醇的进一步开发。