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中药材市场混乱,假冒伪劣产品层出不穷,传统的性状鉴定方法及化学分析方法已难以满足现实需求。近年来,随着基因检测技术对传统分析领域的不断渗透,为了弥补传统中药鉴定技术的不足,已经发展了大量基于基因检测技术的中药鉴定技术,并已正式录入《中华人民共和国药典》,表明基因检测技术将成为一项重要的中药质量控制方法。然而,现有的中药基因检测技术普遍存在提取困难、操作繁琐、用时过长等问题,大大限制了检测效率,难以实现大批量样本的快速检测。因此,为了实现中药材的快速可视化检测,本课题从核酸提取和基因扩增两个方面对现有技术进行了改进,建立了快速的核酸提取方法及快速的可视化基因扩增技术: 1.基于活性炭的中药材DNA的快速提取方法。本研究对活性炭吸附DNA的能力进行了考察,证实了在细胞裂解过程中,活性炭能够吸附释放到裂解液中的DNA起到富集DNA的作用。进一步的研究证实,活性炭也能促进细胞的裂解和DNA的释放,从而提高提取能力,增加DNA模板量。结合简单易得的NaCl溶液,发现活性炭的参与能够让藏红花、甘草、三七花等的DNA模板量都有很大程度的增加,尤其是藏红花的模板量增加了超过30倍。由此,基于“活性炭-NaCl”提取液建立了新的DNA快速提取方法,整个DNA提取过程不超过15min,能够极大提高DNA提取能力和提取效率,非常适用于中药材DNA的提取。 2.中药材的快速可视化基因检测。基于DNA条形码技术和快速PCR(vPCR)的方法,通过优化引物、提高Tm值等方式,建立了针对半夏、藏红花、川贝母的快速PCR体系,将传统PCR所需至少1h的扩增时间缩短至20min左右,大大提高了基因检测效率。通过在PCR产物中加入荧光染料,能够实现对检测结果的可视化快速读取,操作简单快捷,进一步提高了检测效率。结合以上两部分的工作,本课题实现了中药材的简便、快速检测,从核酸提取到结果的可视化呈现,整个过程不超过30min。目前,基于以上方法已建立了半夏、藏红花、川贝母等三种中药材的快速检测体系,在后续的研究中将建立更多的中药材快速检测方法。