苹果不定根发生相关加氧酶基因ARRO-1功能探究

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苹果的主要繁殖方式是嫁接,矮化密植由于具有成形快、早果性强、单位面积产量高、树冠小、方便管理、适合机械化作业等优点而逐渐成为苹果产业的主流发展模式。因此,人们对于砧木的选择也发生了一系列变化,最先采用的是实生砧木,其根系发达,固地性和适应性好,但无矮化效果;随之是矮化中间砧,其具有一定的矮化效果,但中间砧苗木繁育需要两次嫁接,程序繁琐;为了简化育苗程序,将矮化砧木直接再生不定根用作矮化自根砧,其矮化效果较好,但矮化砧木不定根的形成困难,并且其根系浅,根系不发达,固地性差。因此,它们对风等自然灾害的抵抗力较弱。倘若能解决矮化自根砧生根困难的问题,这将会带来巨大的经济效益。文献报道不定根发生相关加氧酶基因ARRO-1在不定根诱导阶段上调表达,推测其与木本植物不定根的形成相关,但ARRO-1蛋白的生化功能未知。因此,研究ARRO-1基因的功能对于揭示木本植物不定根形成的分子机制具有重要的意义。本研究主要获得了以下结果:(1)通过对ARRO-1和其在拟南芥中的同系物基因DAO1、DAO2的生物信息学分析,发现ARRO-1、DAO1和DAO2的cDNA序列相似性为78.72%,ARRO-1、DAO1和DAO2的氨基酸序列相似性为72.26%,相似性较高。(2)构建了35S驱动的ARRO-1、DAO1与GFP的融合表达载体,在烟草中瞬时表达,激光共聚焦显微镜观察,亚细胞定位结果显示ARRO-1和DAO1均定位于细胞质和细胞核中。(3)克隆到ARRO-1基因CDS区上游2.0 kb的序列,序列分析启动子调控元件,通过5’端缺失法构建4个不同长度的ARRO-1启动子片段驱动的GUS报告基因表达载体pARRO-1602、pARRO-1202、pARRO-877、pARRO-328,组织化学染色对ARRO-1的表达特异性进行研究。结果发现,ARRO-1主要在子叶中表达;此外,其在花和果荚中也有轻微水平的表达,经过IBA处理后,GUS染色相对加深,表明ARRO-1启动子对IBA有响应,ARRO-1表达受到IBA的调控;另外发现启动子从5’端缺失逐步缺失到877 bp时,启动子功能基本不受影响,但缺失到328 bp时GUS信号相对1602 bp、1202 bp、877 bp时较弱,启动子功能受到了影响。因此,我们推测从877 bp到328 bp之间的DNA序列上含有基因表达的重要调控元件(位点)。(4)构建了ARRO-1基因的原核表达载体,将其转化进大肠杆菌BL-21,表达并纯化ARRO-1蛋白,通过免疫兔子制备并纯化了ARRO-1抗体。无论是用体外表达的纯蛋白还是用转基因植物总蛋白检验血清抗体,结果都表明我们成功制备了ARRO-1抗体,为后续转基因植株的蛋白水平的鉴定奠定基础。(5)构建了35S::ARRO-1和35S::DAO1和pDAO1::ARRO-1、pDAO1::DAO1植物双元表达载体,分别转化野生型拟南芥和DAO1基因的T-DNA插入突变体dao1-1,获得过表达和互补株系。表型分析结果发现:转进目的基因ARRO-1后,互补株系地下部分的表型包括主根长度,以及不定根的再生能力均得到了很大程度的回复。(6)构建了35S::ARRO-1-GUS和35S::DAO1-GUS、pDAO1::ARRO-1-GUS、pDAO1::DAO1-GUS植物双元表达载体并转化野生型拟南芥,获得了T1代转基因植株,为后续基因表达的组织器官特异性研究准备了材料。综上所述,我们的研究对于ARRO-1的功能有了初步的认识,对于揭示木本植物不定根形成的分子机制具有重要的意义。
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