研究背景前期研究发现在体外培养的鸡胚晶状体皮质性白内障模型中,抑制Src-家族酪氨酸激酶(SFK)活性能有效阻止皮质性白内障的发生,这提示Src-家族酪氨酸激酶的异常激活可能参与皮质性白内障的发生,但其作用机理尚不清楚。在对肿瘤转移的相关研究发现,SFK通过使缝隙连接蛋白Cx43相关位点磷酸化,从而抑制细胞间通过缝隙连接的通讯交通功能。晶状体是一种无血管组织的器官,晶状体上皮细胞和晶状体表层纤维细胞间广泛分布Cx43,它是晶状体实现离子、第二信使、代谢产物和水在细胞间迅速交换的结构基础,对保持晶状体内环境稳定、维持晶状体透明至关重要。实验性皮质性白内障是否通过SFK激活,影响了Cx43的表达、分布或功能,从而参与白内障的发生是本研究关注的问题。目的探讨Src-家族酪氨酸激酶的异常激活在皮质性白内障的形成中对晶状体缝隙连接蛋白Cx43的影响。方法将胚胎10天(E10)的鸡全晶状体分离并培养在含10%FBS的M199培养液中,共培养10天,以此作为对照组;在培养液中加入100nM/ml Src-家族酪氨酸激酶特异性抑制剂PP1的晶状体作为实验组。隔日换液,并观察、拍照记录、测量晶状体的混浊面积,计算晶状体的混浊面积百分比。对培养第1、5和10天两组晶状体进行以下观察:利用WGA和DAPI对晶状体的冰冻切片进行细胞膜和细胞核进行免疫荧光染色,观察晶状体组织学改变;利用透射电镜观察的超微结构变化;通过对缝隙连接蛋白Cx43的免疫荧光染色,观察Cx43分布和表达量的变化;在晶状体前囊膜上进行划痕-染料负荷试验,比较染料弥散距离,评价缝隙连接的功能的变化。分别采用蛋白免疫印迹法和反转录聚合酶链式反应观察Cx43在蛋白和核酸水平表达的变化。结果对照组晶状体在培养的10天里逐渐出现周边部皮质的混浊,混浊面积百分比在第4、10天分别26%和49%,而PP1处理组则为20%和14%,两组间有显著性差异(p<0.01)。第一天,两组晶状体的组织结构和Cx43的表达均没有明显变化;第5、10天对照组晶状体上皮层与晶状体纤维出现分离,晶状体上皮细胞出现死亡,Cx43主要在晶状体上皮细胞间表达;PP1处理后,不仅晶状体上皮细胞间结合紧密,而且晶状体上皮层与纤维之间紧密结合,细胞死亡明显减少,Cx43的表达在上皮与纤维的交界面明显增强。第10天,PP1组晶状体上皮层保持正常结构,Cx43的表达在前囊膜和上皮层之间也有增强。前囊膜的染料负荷试验显示,在第1、5、10天,对照组染料弥散距离分别为50.93±13.19、66.67±7.29、99.52±12.67μm,而PP1组分别为89.54±9.60、69.18±5.49、130.63±10.52μm,第1、10天两组间有显著性差异(p<0.01),PP1组缝隙连接的交通功能明显增强。免疫印迹实验结果显示:在各时间点,PP1有效的抑制了SFK的活性,表现为活性Src(p-Src418)的表达降低(组间差异p<0.01)。以E10晶状体为参照,晶状体上皮中Cx43表达在D1的两组中均有增高,在D5的表达降低,与E10的表达强度相近,在D10时Cx43表达再次升高;两组间Cx43表达在各时间点中,对照组均高于PP1处理组,在D1和D10两组间差异明显(p<0.01)。RT-PCR实验结果显示:两组晶状体上皮中Cx43在mRNA水平的表达均不高于E10对照组,两组间各时间点PP1处理组Cx43的表达均低于对照组(p<0.05),其中D5和D10时差异较大(p<0.05)。结论抑制SFK的异常激活增强了Cx43在晶状体上皮细胞间、上皮细胞和晶状体纤维间的表达,增强了缝隙连接功能,保持了晶状体上皮层的正常结构,从而保持晶状体内环境的稳定,减缓晶状体皮质的混浊发生。SFK对Cx43功能的影响并不是通过增加总的Cx43的表达量实现的,可能是通过影响Cx43磷酸化水平、影响Cx43在细胞膜和细胞浆的分布来实现的。