前言 肾综合征出血热是由布尼亚病毒科汉坦病毒属中某些病毒引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性病毒性传染病。血清学调查证实在五大洲都有汉坦病毒疫源地存在。我国的发病人数居世界首位，每年约5万-8万人，尤其是汉坦病毒中的Ⅰ型(HTV型)和Ⅱ型(SEO型)所引起的HFRS，在中国流行和造成的危害最为严重。辽宁省及沈阳市是主要的流行区。HFRS发病机制复杂、临床表现多样、病情危重易变、并发症多而难治，目前尚无特效的治疗方法，病死率居高不下，直接危害人民的生命健康和经济建设。由于早发现、早诊断和早治疗对患者预后影响很大，因此建立可靠的早期快速诊断方法对其防治具有重要意义。汉坦病毒的基因组由L、M、S三节段组成，为负链RNA病毒。汉坦病毒核蛋白(NP)是汉坦病毒主要的结构蛋白，由S基因所编码，其在宿主体内的表达量最高，免疫原性最强，其刺激机体产生的抗体出现早，且效价高。因此，汉坦病毒的血清学检测一直受到人们的重视。分子生物学技术使人工体外生产病毒特异蛋白成为可能，并可在此基础上建立新的血清学方法，用于临床患者的实验室辅助诊断。我们采用基因工程技术将汉坦病毒S基因克隆并使其在大肠杆菌中获得了表达，以亲和层析法纯化的融合蛋白为抗原，建立间接ELISA方法，用于临床患者血清学检测，获得了满意的结果。现将结果报告如下。 方法 1．S基因的克隆及原核表达载体pGEX-6p-1-hans的构建 以质粒PAC－Hans为模板，采用常规PCR法，扩增汉坦病毒S片段完整编码区基因。PCR产物用＊2％琼脂糖电泳鉴定，经琼脂糖凝胶电泳分析证实为目的基因瞩基因片段）后，PCR产物用Bgl 11和 XhOI双酶切，回收 S基因片段；PGEX－6P一五载体用BamHI和 Xhol双酶切，回收大片段，将目的基因片段和载体按 3：l比例用连接酶进行连接，将所得重组子转化JM109感受态菌，经药物平板筛选，挑取阳性菌落，提取质粒，进行质粒大小比较分析。并用酶切和PCR方法鉴定重组质粒。 2．NP的表达和纯化 将克隆成功的pGEX－6p一二一bans转化到感受态大肠杆菌 E COil：JM 09，从平皿上随机挑取单个转化菌，接种于sndthA（含氮卡青霉素SO卜分d）培养液中，37℃培养过夜，次日取培养物按人100比例种于新鲜LBA培养液1000 IIl中，37 t振荡培养至 A。约 0．4－0．6，加人 IppG终浓度为 0．5rnmoUL，37℃诱导培养5 ／J’时，5000rpm，4℃离心10分钟收集菌体。将离心收集的菌体悬浮于 1八 体积的 PBS中，加人 1％的Tixton＊ 进行超声破碎，将超声破碎的细胞 12000 p，In4℃离心 10分钟，留取上清，用 SDS－PAGE电泳分析。 3．亲合层析纯化及亲合层析柱的再生 参照GST系统说明书进行。纯化后的蛋白用紫外分光光度计测定含量，蛋白计算按IODA。。＝0．sing／Inlo 4．SDS一聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western－blotSDS－PAGE按常规方法进行。纯化产物经12％SDS一聚丙烯酸胺凝胶电泳后，部分凝胶用考马斯亮兰R250染色，观察NP表达纯化情况。另一部分凝胶采用电转印法。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液（含 5％脱脂奶粉的 PBS液）作用 1．5小时，再加用1：20口封闭液稀释的患者血清作用2小时。充分洗涤，加用封闭液作＊ 150稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgG抗体，作用互小时。充分洗涤，加新鲜配制的DAB显色液，避光显色2－8 ·2·分钟。以上反应均在室温进行。 5．酶联免疫方法门）检测特异血清 用纯化的重组核蛋白包被 ELISA板，洗涤后加人 2％的 BSA封闭过夜，洗涤后加人1：lin稀释患者血清，洗涤后加人L10O稀释的＊RP标记的羊抗人 IgG，显色，用 IM硫酸终止反应，然后上机检测。在 490urn波长下观察，以阳性席阴性值）入0判定结果。用方阵滴定法确定包被的核蛋白和患者血清的最佳稀释度。同时设阳性（标准阳性血清）和阴性（正常人血清）作为对照。 结 果 二．S基因的克隆及原核表达载体pGEX－6p习一bans的构建 PCR扩增获得了约为 1．3 kb的 S基因片段；重组质粒 PGEX－6P叫一bans经琼脂糖凝胶电泳分析大小约为6．3 kb与预期结果一致；经 Xhol 酶切 pGEX－6p－1－bans和 pGEX－6p一二，可分另IJ在6．3kb和5．okb处见一明显条带，酶切鉴定结果表明原核表达载体pGEX－6p－l－bans的构建获得了成功。用PCR方法鉴定也证明获得了S基因片段的重组克隆。 二．表达的 NP的 SDS－PAGE和 Wester－blot分析 SDS－PAGE法检测重组株的表达，表达S基因的融合蛋白75kdK蛋白49kd，载体蛋白 26kd；Wester－blot免疫印迹也确证 NP的表达。 3．ELISA法检测患者阳性血清 37例及 100例沈阳地区正常人血清结果 沈阳地区正常人血清出血热酶联免疫检测样本分析结果：样本数（N）＝100，平均值（X）＝0．043，标准差（S）＝0．024。37例肾综合征出血热患者阳性血清ELISA检测，阳性判断标准OD值为阳?