花楸种子生物学和体细胞胚发生体系研究

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花楸(Sorbus pohuashanensis)是我国北方珍贵的具有很高观赏价值和重要经济价值的蔷薇科小乔木树种。本文对花楸种子生物学和体细胞胚发生体系进行了系统的研究,主要研究结果如下:(1)花楸果实和种子具有极丰富的表型变异,种源内的分化高于种源间。果高和果径是关键的果实表型性状,种长和种宽是关键的种子表型性状。种子表型变异在空间分布上呈现以纬度为主的单向变异模式。种子千粒重和生活力在植株间存在极显著差异,低温密封贮藏并不改变这种差异特征。种子发芽起始时间在种源间存在极显著差异,种子发芽率和发芽指数在种源内存在极显著差异。(2)生理因素是导致花楸成熟种子休眠的主要原因,2~5℃低温层积有利于解除花楸种子休眠。花楸果实形状从人工授粉后105d起不再发生显著变化;合子胚在授粉后30d即可完成分化发育至子叶形,75d以后胚的长/宽比值和含水量不再发生显著变化,标志着胚开始进入生理成熟阶段。种皮机械障碍作用是限制调制干燥前发育中的种子萌发的重要因素;水浸泡吸胀和较低的萌发温度有利于成熟种子的萌发。种皮和胚内较高的ABA含量是抑制花楸成熟种子萌发的主要因素。层积前的人工调制干燥过程显著提高了种皮和胚的内源GA3/ABA比值,使种子内源激素平衡向有利于萌发的方向转换。低温层积处理可以显著影响花楸种子内源激素含量和平衡,使花楸种皮内ABA含量大幅度下降,使种皮和胚内的各种生长促进类物质相对含量(尤其是GA3/ABA比值)显著增加。2~5℃低温层积有利于解除花楸种子休眠。低温下密封贮藏对层积中种子生活力的影响极显著。解除休眠后的种子在5℃~25℃的温度范围内均能发芽,此范围内,发芽温度越高种子发芽越早。30℃时种子不萌发。5℃和10℃下,解除休眠的种子的发芽率和发芽指数较高,但发芽较晚。(3) BA、KNO3和高压静电场处理都对种子萌发有促进作用,但以KNO3处理最适合生产应用。200 mg·L-1的6-BA溶液浸泡种子48h后在25℃-5℃变温条件下萌发对花楸种子萌发情况的影响效果最好,其种子发芽初始时间最短(33d),发芽率和发芽势最高。GA3对花楸种子萌发影响不显著;较长时间的ABA浸泡处理抑制花楸种子的萌发。KNO3溶液浸泡处理可以使种子发芽率提高到67%,发芽势提高到54%,平均发芽速达到127,具有操作简单、效果明显、无污染、易推广等适合生产实践要求的特点。静电处理与低温层积处理结合使用不但可以提高花楸种子的发芽率而且可以增强花楸幼苗的抗逆性。(4)利用花楸未成熟和成熟合子胚均可以诱导出体细胞胚,并再生出体胚苗。人工授粉后30d至60d是适合花楸体胚诱导的合子胚取材时期,其中授粉后30d的子叶形合子胚对外源生长类物质的刺激最为敏感,体胚诱导时间最短、诱导率最高。单独使用1mg·L-1的NAA或0.5mg·L-12,4-D时体胚的诱导率最高,分别为66.9%和63.3%,二者差异不显著。当生长素(NAA或2,4-D)和细胞分裂素(6-BA)组合时,不但有利于愈伤组织的诱导,而且可以增加体胚数量。40g·L-1的蔗糖浓度有利于花楸愈伤组织和体胚的诱导。花楸体胚发生兼有直接发生和间接发生两种途径,但以直接发生为主。体胚发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚阶段。经过成熟培养的花楸体胚可以在MS基本培养基上直接萌发,萌发率为38%,植株再生率为10%。低盐和添加少量的NAA有助于花楸体胚苗生根,18℃条件下培养50d的花楸体胚苗生根率可达到90%,高于25℃条件下的生根率。(5)花楸次生体胚发育良好,利用潜力高。花楸初生体胚在添加0.01mg·L-1 NAA的MS培养基上可以诱导产生次生体胚。在添加0.05mg·L-1 NAA和200mg·L-1 CH的MS培养基上,次生体胚的增殖率最高,增殖数量最多。培养基中添加12μmol·L-1ABA、20g·L-1蔗糖和75g·L-1pEG后于强光下培养的体胚成熟率最高。MS比1/2MS更适合花楸次生体胚的萌发,再生植株生长状态良好。每隔30d继代一次可以使花楸次生体胚在长达1年的时间里始终具有胚性。(6)花楸胚性细胞的分裂程序与合子胚相似,体细胞胚具有胚柄结构。第一次分裂为不均等或均等分裂,以后胚性细胞从辐射对称向两侧对称发育。胚性愈伤组织和合子胚表面发生的体胚具有胚柄结构。在胚性愈伤组织中的早期多细胞原胚周围存在大量程序化死亡的细胞。通过以上研究,(1)明确了花楸种子休眠原因并发明了适合生产应用的有效提高花楸种子发芽率的新工艺方法;(2)首次建立了比较完善的花楸体细胞胚发生体系,填补了花楸二倍体体细胞胚发生的研究空白;(3)提出了利用花楸初生体细胞胚为材料,建立花楸次生体细胞胚发生体系,以得到大量发育一致、萌发整齐、再生率高的完整植株的新思路。
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