L-精氨酸对树突状细胞表型及功能的影响

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背景和目的脓毒症(sepsis)是指由感染所导致的全身性炎症反应综合征(SIRS),是严重创伤、烧伤、感染后出现的常见并发症;进一步发展可出现感染性休克、多器官功能障碍综合征(MODS),是临床危重病患者主要死亡原因之一。近年来研究发现,脓毒症的发生、发展与机体免疫功能紊乱密切相关,恢复机体免疫内稳态和内环境平衡,在脓毒症的治疗和改善其预后等方面具有重要意义。而树突状细胞(DC)是功能最强的抗原呈递细胞(APC),被认为是免疫反应的启动者,是免疫反应的主要调节器;可激活天然免疫系统,启动更持久的适应性免疫,诱导胸腺清除自身反应性T细胞,分化调节性T细胞,维持自身免疫耐受。在脓毒症发病过程中,树突状细胞发挥了重要的免疫调节作用,通过改变DC数量及功能来改变脓毒症患者的预后将逐渐成为可能。本研究以外周血单核细胞来源的树突状细胞为研究对象,从细胞免疫表型和抗原提呈能力等方面观察L-精氨酸对树突状细胞功能的影响,以明确L-精氨酸对树突状细胞的调节作用及其机制,以期为L-精氨酸(L-arg)作为免疫调节药物在脓毒症治疗过程中的应用提供依据。方法用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),在12小时贴壁后加入粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4),到第6天将培养的PBMC随机分为A、B、C、D、E、F六组;A组为对照组,仅加入上述细胞因子,B、C、D、E、F组分别加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)10ng/ml,L-arg20μmol/ml,TNF-α10ng/ml+L-arg20μmol/ml、TNF-α10ng/ml+L-arg50μmol/ml、TNF-α10ng/ml+L-arg100μmol/ml,用倒置显微镜每日观察细胞形态。六组分别取培养第1天、第8天的DC,在PBS洗涤后调整细胞浓度为5×106/ml,取100μl悬液加入流式试管中,然后加入FITC标记的CD1a、CD80、HLA-DR,PE标记的CD83的抗体各20μl,避光静置30min,PBS再次洗涤后用流式细胞仪检测其细胞表型。另取健康成人外周血20ml按上述方法分离PBMC,取非贴壁细胞分别与培养至第8天的上述六组DC共同培养4天后,每孔加入MTT液10μl,继续培养1h后加入二甲基亚砜(DMSO)100μl,在酶标仪490nm处测出光密度(OD)值。使用SPSS13.0统计软件进行数据分析,两组间比较采用t检验。结果:除对照组外,其余各组在倒置显微镜下均表现出DC典型的形态学特征。流式细胞仪检测结果显示B(TNF-α)、C(L-arg20μmol/ml)、D(TNF-α+L-arg20μmol/ml)、E(TNF-α+L-arg50μmol/ml)、F(TNF-α+L-arg100μmol/ml)组CD80、CD83、CD1α、HLA-DR表达均高于对照组(均P<0.05);CD80、CD83、CD1α、HLA-DR的表达,B组与C组相比差异无统计学意义(均P>0.05),D组与C组表型表达无明显差异(均P>0.05),E组、F组明显高于B组(均P<0.05);E组和F组也同样明显高于D组(均P<0.05),E、F组之间无明显差异(均P>0.05)。同种异体混合淋巴细胞反应结果显示B、C、D、E、F各组OD值分别为0.36±0.04、0.32±0.04、0.43±0.05、0.88±0.06、0.86±0.07,显著高于对照组的0.09±0.03(均P<0.01),而D、E、F组OD值明显高于B组(均P<0.05)。其中E、F组之间差异无统计学意义(P>0.05),而E、F组OD值高于D组,差异显著(均P<0.05),C组和B组相比无明显差异(均P>0.05)。结论:L-精氨酸可促进DC分化成熟,增加DC表型的表达,并提高DC的抗原提呈能力。有望在脓毒症的免疫调理治疗中发挥重要作用。
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