研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),又称为老年痴呆症,是最常见的中枢神经系统退行性疾病,以不断进展的记忆障碍、全面智能减退以及精神行为异常为主要临床表现。随着人们生活水平和医疗技术的不断提高,我国及世界人口老龄化问题也日趋加剧。据美国权威机构发表的2007年度AD病评估报告显示：有510万美国人患AD症,其中年龄≥65岁(晚发型,late onset)的约占96%(即1/8的65岁以上人口为AD患者),及有20万(约4%)为遗传因素所致的年龄<65岁(早发型,early onset)的患者。并预计到2050年AD患者人数将为现在的三倍,达到约1600万人。且AD病患者年死亡人数(65,829人/2004年)在全美五大最高死亡率疾病中排名第三。我国现有AD患者达350多万,65岁以上老年人总患病率为5.9%,与西方国家资料接近。因此,目前AD已成为国际上脑退行性疾病研究的热点。自德国医生Alois Alzheimer于1906年首次描述AD病症以来的一百多年中,人们对其病理特征、分了机理(包括致病相关基因及其蛋白的功能、相关分子的信号转导等)以及临床治疗的靶点及其药物等方面进行了较多的研究,但至今仍没有很好的治疗剂在临床上应用,因此,对该疾病的分子机理还需要更加深入的研究。AD病相关蛋白包括APP (amyloid precursor protein,淀粉样肽前体蛋白)、Aβ(amyloidβ-peptide,淀粉样肽β)、PS-1 (presenilin-1,早老素-1)、PS-2(presenilin-2,早老素-2)、Tau蛋白(微管稳定蛋白)及ApoE4 (apolipoproteinE4,载脂蛋白E4),到目前为止,APP是研究最为广泛的AD相关蛋白,因为它的酶解产物在AD的发病中起着重要作用。APP在大脑等许多组织中表达丰富,是一种包括由770、751或695个氨基酸组成三种异型体的糖基化跨膜蛋白。APP在两种蛋白酶即β-分泌酶和Y-分泌酶的先后作用下被切割而产生三个片段：(1) sAPPβ:即secreted APP-N terminal,由p-分泌酶裂解APP后分泌至细胞外的可溶性APP-N端片段。(2)Aβ：为β-分泌酶裂解APP产生的APP-C端继续被Y-分泌酶裂解所产生,是AD的主要毒性物,为42肽,可被分泌至脑组织中,在神经元之间及突触部位大量聚集,形成淀粉样斑,又称老年斑,为AD大脑切片的主要病理特征,可使大脑功能受损,导致记忆和认知障碍。(3)AICD (APP intracellular domain):即APP细胞内功能域,为APP被Y-分泌酶(含PS-1或PS-2)切割后留在细胞内的C-端59肽,是APP分子中与其它蛋白／转录因子相结合而发挥基因调控作用的功能区。对于一个功能性蛋白分子而言,其生物功能的发挥,可通过两种方式来实现：一是直接作用方式,即通过其自身或其分子片段与和它直接作用的分子相结合实现,如蛋白-蛋白相互作用(信号转导和变构调节等)及蛋白-核酸相互作用(基因调控等)。二是间接影响方式,即通过与上述直接影响因素相关联的下一级分子而体现,且这种影响可能是多级的。因此,各功能蛋白的作用是网络状的,APP分子及其片段Aβ和AICD等的作用也不例外。所以,阐明APP蛋白的生物功能是探索AD病分子机理的关键。如上所述,AICD是APP分子发挥生物功能的细胞内功能域,因而,近来的许多研究都集中在AICD是否可作为转录因子参与基因调控作用。2001年,Cao和Sudhof在《Science》上首次报道了AICD通过与Fe65和Tip60形成蛋白三聚体复合物(AICD-Fe65-Tip60)作为转录激活物,激活了质粒上荧光素酶(luciferase)报告基因在PC12, HeLa等细胞中的高表达。在此复合物中,Fe65为APP结合蛋白(APBB1),进入细胞核内起转录因子的作用,可调控多个基因,膜上APP的AICD段可将其限制在胞浆而不能入核。Tip60为分子量约60KDA的组蛋白乙酰转移酶(HTATIP),可受多种信号的控制进行染色体的重构(remodeling),这些信号包括：STAT-3 (signal transducer and activator of transcription-3)、CREB及c-myc等。2004年,Rotz等的研究表明：AICD可通过正反馈机制使其自身的前体蛋白APP的基因表达上调。提示AICD起着APP切割信号的作用,导致全长APP分子的量得到不断补充。在此后的研究中,有的作者对已报道的受AICD调控基因(如：KA11,糖原合成酶-3, Neprilysin,包括APP基因)提出了不同的看法,这是由于以往的实验多来自对质粒上目的基因调控的观察或得自蛋白功能的间接影响方式,如通过抑制γ-分泌酶所观察的结果,而缺乏AICD的直接作用即直接与被调控基因的调控序列(启动子)相结合的结果。2007年,Muller等将构建的三种真核共表达质粒AICD/EGFP(绿色荧光蛋白)、AICD/Fe65及EGFP(对照)转染神经母细胞瘤细胞系(SHEP-SF)后,采用检测基因表达水平的基因芯片法(Affymetrix Genechip,美国Affymetrix公司产品)对AICD过表达情况下基因的表达变化(mRNA水平)做了研究。他们在备选出8个上调基因的基础上,经过进一步鉴定,选出了三个高表达基因：α2-Actin (ACTA2)、Transgelin (actin交联蛋白,TAGLN)和Tropomyosin 1 (TPM1),它们均与细胞的肌动蛋白(actin)相关联,存在于细胞骨架之中,且actin的稳定性被认为与衰老有关。由于上述研究是在RNA水平的观察,实质上是观察了AICD对基因表达的网络式多因素综合作用结果,却未给出AICD在基因组上即DNA水平直接调控或结合的基因信息,而获得此信息可以从根本上阐明APP/AICD的基因调控靶点,为了解AD的分子机理及临床治疗药物的开发提供依据,因为从“根”上阻断或改变一个基因或其蛋白的功能是最直接和有效的,而迄今为止,尚无有关AICD在DNA水平上的基因调控信息的研究报道。染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation, ChIP)是一种用于研究蛋白质与染色质DNA相互作用的实验方法,可检测细胞内已知蛋白质能否结合到特定DNA序列以及与何种DNA区域相结合。此方法通过用甲醛将实验细胞中的蛋白质交联并固定在其结合的特定DNA部位,然后用酶剪切染色质DNA至适当片段,再用目的蛋白的特异抗体将其结合的染色质DNA片段沉淀下来,最后经解交联及PCR扩增即可获得目的蛋白所结合的染色质DNA片段或基因序列。因而ChIP可用于转录因子直接结合的调控序列及基因的研究中。本课题基于ChIP的实验原理,通过发现AICD在染色体上的结合位点,本课题第一次在DNA水平对APP/AICD的基因调控信息及其与AD病学习和记忆功能障碍的关系进行了研究。在木研究中我们首次克隆了几个可能是基因调控区序列的AICD在染色质DNA上的结合片段,这些DNA片段的同源基因与细胞骨架、信号转导及糖原合成代谢等生理过程的调控有关。而更为重要的是,我们通过基因测序在AICD所结合的DNA片段中鉴定出了两个与大脑学习和记忆相关的基因即CaMKⅡα和GluR-2基因的启动子区DNA片段,并经EMSA和Western blot实验证实了AICD以与海马细胞中其它衔接蛋白形成蛋白复合体的形式直接与这两个基因的启动子相结合,提示AICD参与了大脑学习和记忆功能形成过程中相关基因的转录调控过程,从而在基因水平,将AICD与AD病学习和记忆功能障碍的临床表现直接联系起来,为AD病的分子作用机理提供了新的重要内容,这在国内外均无相关报道。研究内容第一部分AICD59/pMAL-c2质粒构建及MBP-AICD59融合蛋白的表达与纯化及其性状研究目的构建MBP-AICD59融合蛋白表达质粒AICD/pMAL-c2,然后将其转化到大肠杆菌进行原核表达,制备纯化的MBP-AICD59融合蛋白,并用凝血酶对融合蛋白进行切割以获得AICD59多肽。同时通过MBP-AICD59融合蛋白和MBP与大鼠海马细胞总蛋白提取液的反应差异来研究AICD多肽所结合的蛋白。方法设计并合成引物,以APP695全长为DNA模板,通过PCR扩增获得编码AICD59的基因片段,将此片段连接到载体pMAL-c2,获得质粒AICD59/pMAL-c2,然后转化此质粒到大肠杆菌E.coli DH5a细胞,挑取克隆进行扩大培养后提取质粒对插入DNA片段进行测序,确定插段序列为编码AICD59基因之后,再将AICD/pMAL-c2转化到大肠杆菌E.coli BL21细胞,挑取克隆,鉴定为阳性者进行扩大培养,加入诱导剂进行诱导表达,然后回收并裂解菌体、离心后取上清液。通过亲和色谱的方法,将上清液通过多聚麦芽糖(amylos)亲和色谱柱,用含10mM麦芽糖的柱缓冲液洗柱后,MBP-AICD59融合蛋白即从层析柱上解离下来,从而获得纯化的MBP-AICD59融合蛋白。用凝血酶对纯化融合蛋白进行切割,获得AICD59多肽及MBP。通过蛋白印迹实验(Western blot),以MBP为对照,检测MBP-AICD59融合蛋白和AICD59多肽与抗AICD抗体反应的特异性。同时,提取大鼠海马细胞总蛋白,加入MBP-AICD59融合蛋白并以MBP作对照与其共育,通过SDS-PAGE电泳,观察AICD是否可与大鼠海马细胞总蛋白提取液中特定蛋白发生结合。结果1.获得AICD/pMAL-c2质粒,表达出MBP-AICD59融合蛋白,且通过亲和层析法得到纯化的MBP-AICD59融合蛋白,并用凝血酶切割后得到AICD59多肽。2. MBP-AICD59融合蛋白、AICD59多肽在蛋白印迹实验中均可被抗AICD抗体检测,而对MBP具有阴性结果。3. AICD结合了大鼠海马细胞总蛋白中特定分子量的蛋白质。第二部分AICD在染色质DNA上结合位点的定位及其基因调控功能分析目的通过对含AICD蛋白-染色质DNA复合体进行交联固定、酶切及经特异AICD抗体的免疫沉淀作用,获得AICD或其蛋白复合体在染色质DNA上结合位点的DNA片段,在此基础上对AICD参与调控的基因进行定位和分析。方法取1日龄大鼠海马作原代海马神经元培养,10天后用1%甲醛处理细胞,交联并固定细胞核内蛋白-染色质复合体,严格按照ChIP (chromatin immunoprecipitation,染色质免疫沉淀法)实验方案(Active Motif公司ChIP-ITTM Express Magnetic Immunoprecipitation Kit Manual),采用试剂盒ChIP-ITTM Express Enzymatic Kit,提取细胞核染色体并酶切至约200-1000bp,用酶切后的染色质片段与蛋白G磁珠和抗AICD抗体或非特异性IgG(阴性对照)过夜孵育,然后在洗脱液的作用下将抗AICD抗体-AICD或含AICD蛋白复合体-染色质DNA复合体从磁珠上分离下来,沉淀磁珠后,分离出抗AICD抗体-AICD或含AICD蛋白复合体-染色质DNA复合体,通过解交联及蛋白酶的作用将此复合体上的抗AICD抗体及AICD或含AICD蛋白复合体酶解,获得AICD或含AICD蛋白复合体所结合的染色质DNA片段。利用重组末端脱氧核苷酸转移酶对这些未知的DNA片段3’-OH端加上多聚脱氧三磷酸腺苷(dATP)尾,并以带有限制性核酸内切酶PstI位点的多聚脱氧三磷酸胸苷引物(5’-GTCTCTGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTNN-3’, NN为两个任意碱基)作PCR扩增。将扩增出来的片段用PstI酶切后连接到pMAL-c2载体并转化到大肠杆菌E.cloi DH5α,挑取克隆提取质粒进行测序,插段序列即为AICD或其蛋白复合体所结合的染色质DNA片段的序列,然后用局部序列对比工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)找出与其生物学属性高度相似的基因。对经ChIP法所获得的AICD或其蛋白复合体结合的染色质DNA片段,用与学习／记忆相关基因的启动子特异引物进行PCR,观察是否可扩增出相应基因启动子片段,并通过测序加以鉴定。将测序后的DNA片段与SD大鼠海马细胞总蛋白提取物共育做电泳迁移率实验(EMSA),观察DNA片段是否与海马细胞蛋白结合,然后再通过电泳转移到PVDF膜,用抗AICD抗体做Western blot以验证所获得的染色质DNA片段是否还可被AICD所结合。结果1.获得海马神经元细胞核内蛋白-染色质复合体提取物,并将染色质酶切为约200-1000bp片段,为下一步的ChIP法获取基因调控区DNA片段奠定了物质基础。2.获得用特异性AICD抗体免疫沉淀下来的AICD或其蛋白复合体所结合的染色质DNA片段,并通过基因转化和克隆测序得到这些片段的基因序列,进一步通过局部基因序列对比发现这些序列的同源基因,它们包括乙酰辅酶A酰基转移酶2 (ACAA2)基因、糖原激酶2(GYG2)基因、膜相关性磷脂酰肌醇转移蛋白2 (PITPNM2)基因以及SETEX基因。3.在国内外首次用记忆相关性基因启动子的引物经PCR鉴定出两个学习和记忆相关基因即CaMKⅡ和GluR-2基因的启动子区域DNA片段。结论1.所获得的MBP-AICD59融合蛋白与AICD59多肽均可与特异性AICD抗体即抗APP-C末端抗体发生反应,而MBP不能与该抗体反应,表明MBP-AICD59融合蛋白、AICD59多肽均具有良好免疫原性,且抗AICD抗体的特异性良好,三者均可用于ChIP实验。2. MBP-AICD59融合蛋白可结合大鼠海马细胞总蛋白提取液中的特定蛋白。3.海马神经元细胞染色质DNA上存在有AICD(或其蛋白复合体)的结合位点,通过对结合位点作基因比对发现,AICD结合的基因与调控细胞骨架、信号转导及糖原合成代谢有关。4. AICD可与学习和记忆相关性基因的启动子区域相结合,提示AICD对学习和记忆相关基因具有潜在的基因转录调控作用,这在国内外均为首次发现,可为AD病的分子机理研究及研制有效的临床治疗剂提供重要的实验依据。