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生物材料一旦植入人体内,就会引起宿主反应。这种宿主对植入生物材料的反应在一定程度上会影响材料的功能性,并调节随后的组织修复和重塑。巨噬细胞是宿主对生物材料反应的关键细胞之一,可极化成不同表型,在再生医学中具有重要意义。目前,壳聚糖基生物材料被广泛应用于组织再生与修复的研究当中,大量研究表明,壳聚糖具有良好的生物相容性,能够调节免疫与炎症反应的程度,对组织修复有着良好的促进作用。然而,在植入宿主体内后,壳聚糖基生物材料及其降解产物是如何对机体产生作用的目前尚不明确,因此,研究壳聚糖基生物材料在体内的降解产物的作用机制具有非常重要的研究意义。本课题的目的是研究壳寡糖(COS)对巨噬细胞(RAW 264.7)极化调节的影响,以及巨噬细胞极化后对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的早期成骨化及促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)参与血管形成的作用。首先,探究高、低剂量(40μg/mL、4μg/mL)以及不同聚合度(3、4、5和6)的壳寡糖对巨噬细胞增殖、分泌炎症因子及细胞膜分子表达的影响,利用高通量蛋白芯片技术分析了壳寡糖对巨噬细胞分泌炎症因子的作用机制,在初步探明剂量及聚合度对上述作用的效果的基础上,将上述浓度和聚合度的壳寡糖与巨噬细胞培养所得的上清培养基作为条件培养基培养BMSCs及HUVECs,并分别进行细胞增殖、碱性磷酸酶活性、PCR、Western Blot、细胞迁移、ELISA试剂盒测试等实验,探究条件培养基对干细胞成骨性能以及促进内皮细胞参与血管形成的影响。然后再利用高通量蛋白芯片技术,探明壳寡糖对巨噬细胞极化后影响的微环境(即条件培养基)对BMSCs成骨分化及促进成血管性能的作用过程。最后,利用Transwell小室将巨噬细胞与小鼠骨髓间充质干细胞、小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)在含有壳寡糖的培养液进行共培养,通过一系列检测手段,验证在无诱导剂的情况下,壳寡糖介导的巨噬细胞极化具有成骨和成血管性能的结果。结果表明,壳寡糖可使巨噬细胞向M2型极化,其中4μg/mL的壳寡糖和壳五糖效果最明显,具体表现为可以上调白细胞介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)等抗炎因子以及巨噬细胞膜CD206分子(M2)表达,下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-17(IL-17)等促炎因子以及膜CD80分子(M1)的表达,该结果与IL-4刺激巨噬细胞后的细胞行为类似。同时4μg/mL壳寡糖和壳五糖都能促进巨噬细胞分泌相关成骨蛋白(DKK-1、OPN、Osteoactivin等)和成血管相关蛋白(VEGF R1、EGF、IGFBP-5等),从而促进BMSCs早期成骨分化和HUVECs参与的血管化过程。具体表现为促进BMSCs增殖,上调BMSCs的成骨基因和蛋白表达;促进内皮细胞生长增殖和迁移,上调促血管生成因子表达。最后,Transwells小室共培养实验结果表明,在4μg/mL壳寡糖和壳五糖培养液条件下,巨噬细胞与BMSCs共培养均能够促进BMSCs早期成骨分化,表现为干细胞增殖活性增加、早期(3天)细胞碱性磷酸酶活性提高,典型的早期成骨分化相关基因ALP、COL-I、RUNX2、OCN的表达明显上调。另一方面,分别在4μg/mL壳寡糖和壳五糖培养液条件下,巨噬细胞与内皮细胞(MAECs)共培养也能够促进内皮细胞增殖、迁移,上调血管生成相关基因的表达。综上所述,低浓度和合适聚合度的壳寡糖对巨噬细胞向M2极化,参与抗炎反应且具有促进作用,并且可以在不使用成骨、成血管诱导剂的情况下促进骨生成/血管生成,促进组织再生。