论文部分内容阅读
自然界中存在两种果聚糖,按照糖苷键型的差异可分为菊糖和levan型果聚糖。菊糖在一些菊科植物中含量丰富,具有许多优异的性质和生理功能,已被作为可溶性膳食纤维,应用于食品、医药等许多领域。目前,工业化的菊糖大多来自植物菊苣,相反,levan型果聚糖主要来自微生物,植物中含量很少。国内尚没有关于微生物来源菊糖的报道,实际上,一些微生物可通过菊糖蔗糖酶（Inulosucrase,EC:2.1.4.9）以蔗糖为唯一底物,一步合成菊糖。众所周知,多糖的分子量是影响其性质和功能的关键因素,而微生物菊糖与植物菊糖的主要不同在于分子量,微生物菊糖的分子量一般在106 g/mol以上,是植物菊糖的百倍。即使如此,微生物菊糖及菊糖蔗糖酶仍未得到足够的重视。本课题鉴定了一种来源于乳酸菌L.gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶,并对酶学性质和产物多糖的键型进行鉴定。之后,对菊糖合成条件进行优化。最后,通过定点突变获得了使酶活和稳定性提高的正突变。本课题利用不同的N-端截断方式构建重组菊糖蔗糖酶。相应的截断基因插入进载体pET-22b（+）中,构建重组质粒。重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）内,IPTG诱导重组酶的过量表达。通过检测两种截断的菊糖蔗糖酶在最适pH和温度下的活力表明:不同的N-端截断方式仅改变了菊糖蔗糖酶的最适pH和温度,对酶活的影响不大。酶学性质鉴定表明,Laga-ISase（截断信号肽、N-端的101个氨基酸和C-端）总酶活的最适pH和最适温度分别为pH 5.5和35℃。大部分二价金属离子对Laga-ISase酶活有促进作用,其中Mn2+可以将酶活提高至157%。热稳定性研究表明,45℃保温3 h,残余酶活仍保持为原始酶活的84%,为目前已经鉴定的菊糖蔗糖酶中热稳定性最高的。结构稳定性研究表明,Laga-ISase的变性温度为55℃。对Laga-ISase的反应动力学研究表明,该酶的总酶活和转糖苷酶活的反应动力学行为不遵循米氏方程。而水解酶活符合米氏方程底物饱和的典型特点,且水解酶活的Km为44.12 mmol/L。通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振检测产物多糖的糖苷键型,确定产物为β-（2,1）糖苷键连接的菊糖。以30%蔗糖为底物,对酶法合成菊糖的条件进行优化,获得菊糖合成的最适加酶量和时间分别为:4.5 U/g蔗糖和1.5 h。在最适条件下,获得的菊糖的分子量为5.86′106 g/mol。之后,通过分子生物学手段结合计算模拟和理性设计,获得13个定点突变的突变体。通过对突变体酶的活力和结构稳定性进行研究,发现了对酶活和结构稳定性起重要作用的关键位点。其中,Q196E的总酶活和Tm值分别降低至野生酶的37.8%和54.2℃,这表明残基Gln196对酶的活力和结构稳定性具有重要作用。另外,获得了使酶活提高的正突变,突变体D288E的酶活为野生酶的131.5%。大部分突变体的Tm值增加,其中A310E、S346A、I478M和A491S的Tm值分别较野生酶提高了1.38、1.39、1.83和1.31℃。