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近年来MSC由于其在免疫调节、组织修复中的重要作用被投入临床研究,而与此同时,MSC对肿瘤的作用也被人们所担忧。其中MSC对结肠癌细胞的作用与相应机制依然不清楚。目的:(1)阐明MSC上清对结肠癌细胞系生物学特性的影响(2)对相应机制以及对结肠癌中重要的信号通路的影响进行进一步的研究(3)明确MSC上清对结肠癌细胞成瘤性的影响方法:(1)以α-MEM做为对照,使用MSC的24h上清(MSC-CM)刺激结肠癌细胞系后24h,使用MTT法检测6d中结肠癌细胞系增殖的变化,使用Brd U、Ki67荧光染色的方法分别检测结肠癌细胞S期与增殖期细胞的比例变化、JC-1测定结肠癌细胞线粒体膜电位的变化以及PI染色法确定细胞周期的变化,并同时使用Transwell检测结肠癌细胞迁移能力的变化,在将MSC-CM与结肠癌细胞系混合后软琼脂半固体培养基与平板培养检测克隆形成能力的变化。(2)MSC-CM刺激24h后,使用western blot(免疫印迹)检测细胞周期相关蛋白P53、P16、P21的变化,同时使用QPCR检测RNA水平的变化,随后使用western blot、QPCR检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、干性相关标记物c-myc、OCT-4、Sox-2在蛋白与RNA水平的表达,同时使用ELISA检测MSC-CM以及浓缩后的MSC-CM中IL-6、IL-8的表达。并同时使用QPCR与western blot确定MSC-CM刺激24h后AMPK/m TOR通路以及NF-κB通路的变化,凝胶迁移实验(EMSA)检测NF-κB转录活性的变化。(3)将浓缩50倍的MSC-CM与结肠癌细胞系腹腔注射入Balb/c体内,通过监测小鼠体重、肿瘤转移小鼠数量以及对小鼠肠免疫组化检测HE、Ki67、E-Cadherin的变化。结果:(1)与对照培养基相比,MSC-CM刺激后的结肠癌细胞系HCT-116与LOVO增殖明显增加,同时S期细胞与增殖期细胞比例也有显著增加。与此同时12h时结肠癌细胞迁移比率、14d后结肠癌细胞克隆形成数量、大小也明显增加,结肠癌细胞的凋亡比率下降、细胞周期中G1期比例下降,S期与G2期上升。(2)与对照培养基相比,MSC-CM刺激后结肠癌细胞系中的细胞周期、凋亡相关蛋白P53、Bax蛋白与RNA水平表达受到抑制,抑制凋亡蛋白Bcl-2在RNA水平表达上升,同时P21、P16表达也受到抑制,结肠癌细胞系干性基因c-myc、oct-4、sox-2在RNA水平表达上升,c-myc、sox-2在蛋白水平的表达也有增加。与此同时,使用ELISA确认了相对于HCT-116上清中IL-6:240±52.91(pg/ml)、IL-8:220±36.06(pg/ml),MSC-CM中IL-6的表达达到1083.33±144.34(pg/ml),IL-8达到733.33±104.08(pg/ml),在MSC-CM处理后的上清中,IL-6达到1406.67±143.64(pg/ml),IL-8达到830±65.57(pg/ml),而在50倍浓缩后的MSC-CM中,IL-6达到41700±1808.31(pg/ml),IL-8达到29600±1967.23(pg/ml)。在检测MSC-CM刺激后AMPK/m TOR与NF-κB通路的变化后发现AMPK磷酸化水平受到抑制,m TOR磷酸化水平上升,NF-κB通路中P65亚基磷酸化上升,抑制因子IKBα磷酸化降低,IKBα降解增加,同时NF-κB转录活性也得到增强。(3)进一步使用浓缩后的MSC-CM与HCT-116混合腹腔注射入Balb/c小鼠,能够得出小鼠体重下降、结肠成瘤数量上升,同时瘤体中HE、Ki67染色阳性细胞数目增加,E-Cadherin降低。结论:在MSC-CM的刺激下,结肠癌细胞系增殖、迁移、克隆形成能力增加、凋亡受到抑制,同时结肠癌细胞系细胞周期G1期比例下降、S期与G2期上升。细胞周期相关蛋白表达增高,而抑制凋亡蛋白比例下降,结肠癌细胞干性增强。MSC-CM对结肠癌细胞的作用机制与MSC-CM中高浓度IL-6、IL-8激活AMPK/m TOR、NF-κB通路有关。同时MSC-CM能够增加HCT-116在Balb/c小鼠中的成瘤性。