【摘 要】
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背景肝细胞癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤,发病率和死亡率逐年上升,严重危害人类的健康。目前,其预防和治疗仍然是一个全球性的挑战。随着人们对免疫系统认识的提高,利用恢复肿瘤患者自身的免疫系统来对抗肿瘤让人们充满了期待。CpG ODN能够通过激活机体免疫细胞的TLR9,进而增强抗肿瘤免疫反应。指导教师前期证实一种CpG ODN序列,能够有效发挥抗肝细胞癌荷瘤小鼠的作用。由于肿瘤发生的多样性,单一疗法的
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背景肝细胞癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤,发病率和死亡率逐年上升,严重危害人类的健康。目前,其预防和治疗仍然是一个全球性的挑战。随着人们对免疫系统认识的提高,利用恢复肿瘤患者自身的免疫系统来对抗肿瘤让人们充满了期待。CpG ODN能够通过激活机体免疫细胞的TLR9,进而增强抗肿瘤免疫反应。指导教师前期证实一种CpG ODN序列,能够有效发挥抗肝细胞癌荷瘤小鼠的作用。由于肿瘤发生的多样性,单一疗法的效果往往不佳,如何使用多个药物联合成为了人们探索的重点。前期研究发现,硝呋齐特（Nifuroxazide）作为一种广谱抗菌药物,其能够显著抑制细胞中p-Stat3的表达。研究揭示,CpG ODN联合Stat3抑制剂能够有效地发挥抗肝细胞癌作用。目的探索CpG ODN联合硝呋齐特对肝细胞癌的治疗作用及其机制。方法1.体外实验将处于对数生长期的Hep G2细胞铺板,放置培养箱进行培养,分别加入不同浓度的硝呋齐特,药物对细胞活力的影响采用CCK-8实验检测;药物对细胞迁移的影响采用细胞划痕实验来检测;药物对细胞中蛋白表达的影响采用Western blot来检测;药物对细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测。2.体内实验（1）消化小鼠肝细胞癌H22细胞,重悬,并计算活细胞比例,用PBS制成浓度为2×107细胞/ml的细胞悬液,置于冰盒内,于C57BL/6小鼠右后肢皮下注射100μl,造模。（2）造模后第7天,小鼠被随机分为四组:PBS组、硝呋齐特组、CpG ODN组和硝呋齐特联合CpG ODN组,每组5只小鼠。PBS组小鼠瘤内注入100μl/只PBS,硝呋齐特组小鼠瘤内注入200μg/只的硝呋齐特,CpG ODN组小鼠腹股沟淋巴结注射20μg/只的CpG ODN,硝呋齐特+CpG ODN组小鼠注入200μg/只的硝呋齐特和20μg/只的CpG ODN。CpG ODN每隔一天注射1次,硝呋齐特每日注射1次。所有治疗持续1周。治疗结束后第7天处死小鼠,切除肿瘤标本,测量肿瘤重量。通过western blot方法检测肿瘤组织中Casepase-3及Stat3等蛋白的表达;利用免疫荧光技术检测肿瘤组织中免疫细胞的浸润;采用TUNEL实验检测肿瘤组织中细胞凋亡;应用流式细胞术检测小鼠脾脏中T淋巴细胞的比例。结果1.硝呋齐特对Hep G2细胞具有一定的杀伤作用;2.硝呋齐特抑制了Hep G2细胞的迁移,增加了Hep G2细胞的凋亡;3.硝呋齐特作用于Hep G2细胞后,显著影响了细胞中肿瘤相关蛋白p-Stat3、Stat3、MMP2、Cleaved-Caspase3的表达;4.肝细胞癌荷瘤动物模型中,硝呋齐特联合CpG ODN有效抑制了小鼠肿瘤的生长;5.联合治疗显著抑制了肝细胞癌细胞中Stat3的磷酸化;6.联合治疗显著增加了肝细胞癌组织中细胞的凋亡;7.联合治疗组小鼠肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润显著增加,同时脾脏中CD4+及CD8+T淋巴细胞的比率均有所提高。结论CpG ODN联合硝呋齐特治疗显著抑制了肝细胞癌荷瘤小鼠肿瘤的生长速度,增加了肿瘤细胞的凋亡,提高了T淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润以及脾脏中的比率,发挥了显著的协同抗小鼠肝细胞癌作用。该论文为临床上肝细胞癌的联合治疗提供了一种新的药物组合及实验理论依据。
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