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研究背景:胃癌具有发病率高、转移率高、死亡率高的三高特点,且早期诊断率低,严重影响人类的生命健康。胃癌的发生、发展是个复杂的生物学过程,根据经典的Correa假说,认为其沿着“正常胃黏膜→慢性非萎缩性胃炎→慢性萎缩性胃炎(CAG)→肠上皮化生(IM)→异型增生(Dys)→胃腺癌”方向发展,其中不完全肠上皮化生、异型增生因癌变风险较高,故被称为胃癌前病变(GPL)。鉴于胃癌无特效治疗药,因此,治疗、延缓GPL进展为胃癌,成为预防胃癌的有效措施。中药能有效改善GPL患者的临床症状,阻断和改善GPL病理的恶性进展,加之中药多靶点、服用安全的特点,使中医药治疗GPL上受到越来越受重视。前期研究发现,亚硝基胍(MNNG)所致GPL大鼠动物个体差异大、造模周期长,采用基因敲除技术结合隔日禁食,可复制出个体差异小、周期短的脾虚证GPL小鼠模型;健脾化瘀解毒中药可通过调控PI3K/AKT/mTOR通路抑制有氧糖酵解(AEG)及胃黏膜上皮细胞(GECs)的过度增殖、凋亡和自噬,但其确切机制尚不明确。因此,本论文通过探索健脾化瘀解毒中药胃痞灵(WPL)调控mTOR/HIF-1 α/SIRT6信号通路介导的AEG,调节胃黏膜局部微环境,旨在阐明GPL的发病机制及中药治疗GPL的效应和分子机制。目的:1.采用基因工程技术敲除C57BL/6J小鼠胃黏膜壁细胞H+-K+-ATP酶α亚基,构建Atp4a-/-小鼠。通过动态观察胃黏膜病理学变化、胃黏膜上皮细胞生物学行为(增殖、凋亡、分化等)及GPL分子标志物的表达(MUC2、Ki-67等),建立、筛选并鉴定GPL小鼠模型;2.在前期GPL大鼠胃黏膜细胞有氧糖酵解(AEG)代谢研究基础上,通过观察Atp4a-/-小鼠AEG代谢限速酶及转运蛋白的表达,从AEG角度探讨GPL和胃癌的发病机制;3.在前期GPL大鼠AEG代谢PI3K/AKT/mTOR信号通路调控机制研究基础上,通过观察GPL模型Atp4-/-鼠mTOR/HIF-1 α/SIRT6活性,从mTOR信号转导通路的下游深入探讨GPL的AEG信号转导调控机制;4.在前期健脾化瘀解毒中药下调PI3K/AKT/mTOR抑制GPL大鼠AEG所致GECs增殖、凋亡失衡和自噬抑制基础上,深入探讨WPL干预mTOR通路下游抑制AEG及改善Atp4a-/-小鼠胃黏膜萎缩、肠化的药效与分子机制。方法:1.GPL模型Atp4a-/-小鼠的复制:①Atp4a-/-小鼠的构建:通过检索C57BL/6J小鼠胃黏膜壁细胞H+K+-ATP酶α亚基编码基因结构,确定转录本、翻译起止位点及编码蛋白,采用CRISPR/Cas9技术对Atp4a基因进行编辑,设计sg RNA,制备sg RNA和Cas9mRNA,将sg RNA和Cas9mRNA注入C57BL/6J小鼠受精卵中,注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管,获得并筛选验证阳性F0代小鼠,阳性F0通过与野生型小鼠交配获得F1代杂合子小鼠。继续扩繁直到获得F3代纯合子小鼠,PCR技术鉴定基因型。②GPL小鼠动物模型的复制与鉴定:取F3代及以后同代Atp4a-/--小鼠30只,以20只同窝野生型(WT)小鼠为空白组,随机取10只Atp4a-/-小鼠和5只WT小鼠动态观察鼠龄第10周、12周、14周、16周胃黏膜病理:萎缩、IM和Dys(程度、范围与分级),同时测定GECs增殖、凋亡分子标志物(MUC2、Ki-67、p53)、AEG代谢(LDHA)、mTOR/HIF-1 α 信号通路(PI3K、AKT、mTOR、HIF-1 α)。2.胃痞灵对GPL模型Atp4a-/-小鼠AEG代谢调控机制研究:取10只WT小鼠为空白组,取50只Atp4a-/-小鼠随机均分为模型组(Model)、维酶素组(VIT,0.2g·kg-1)、WPL高剂量组(WPL-H,15g·kg-1)、低剂量组(WPL-L,7.5g·kg-1)4组,除空白组外,其余各给药组小鼠采用隔日禁食法,造模第10周开始连续灌胃给药,连续10周,末次给药后1.5-2小时处死小鼠,取胃窦部胃黏膜,用于测定胃黏膜上皮细胞mTOR/HIF-1 α/SIRT6 信号通路(PI3K、p-AKT、mTOR、HIF-1 α、SIRT6、AMPK、TSC1、TSC2、Rheb、NF-κ B)、AEG 代谢通路(HK-II、PKM2、ENO1、MPC1 和 LDHA)、肠上皮化生分子物(CDX2、MUC2)、增殖(Ki-67)、凋亡(p53)和转移(Lgr5+)功能蛋白的表达。结果:(一)Atp4a-/-小鼠模型胃黏膜病理结构变化与表型特征与WT小鼠相比,10周龄的Atp4-/-鼠胃黏膜黏膜屏障缺损、消失,腺体排列紊乱,腺体之间腔隙增大,小肠型肠上皮化生杯状细胞增多,组织异形性大肠型肠上皮化生。基底膜增厚,厚薄不均。可见黏膜下层炎性细胞浸润,形成前淋巴结小体。随着鼠龄的增加,腺体萎缩程度加重,基底膜逐渐增厚,肠上皮化生及细胞异型性更明显。AB-PAS染色Atp4a-/-小鼠10周即出现胃黏膜上皮细胞分泌酸性糖蛋白及蛋白多糖黏液,可见较明显蓝染灶,病灶范围较广、染色较深,以小肠型肠上皮化生为主。随着鼠龄的增加,肠上皮化生的范围和程度逐渐增加。10周龄Atp4a-/-小鼠胃黏膜MUC2、Ki-67 和 p53 阳性表达。mTOR/HIF-1 α 信号通路关键分子(PI3K、p-AKT、mmTOR、HIF-1 α)、AEG关键酶(LDHA)与WT组比较有显著性增加(P<0.05)。(二)胃痞灵对GPL动物模型Atp4a-/-小鼠胃黏膜病理组织形态学的影响观察不同剂量的WPL对10周龄的Atp4a-/-小鼠的影响。H&E和AB-PAS染色发现:各给药组胃黏膜组织较模型组腺体排列相对整齐,腺体形态尚规则,少见“背靠背”或复层改变;胃黏膜上皮可见部分杯状细胞,基底侧可见细胞核深染、增大、重叠、极性减弱,核仁突出,见明显核分裂现象,但较模型组明显减轻。AB-PAS染色观察可见,WPL各剂量组小鼠肠上皮化生区域较模型组减少、减弱。(三)胃痞灵对GPL小鼠胃黏膜细胞生物学行为的影响与模型组相比,WPL-H、WPL-L组Atp4a-/-小鼠胃黏膜CDX2、MUC2、Ki-67、p53、Lgr5+蛋白显著性降低(P<0.05)。(四)胃痞灵对GPL小鼠胃黏膜mTOR/HIF-1 α/SIRT6信号通路介导的AEG关键分子的调控与模型组相比;WPL-H、WPL-L组胃黏膜的AEG关键酶和转运蛋白如HK-II、PKM2、ENO1、MPC1和LDHA均有显著性降低(P<0.05);WPL-H、WPL-L组Atp4a-/-小鼠胃黏膜 PI3K、p-AKT、mTOR、HIF-1 α、AMPK、Rheb、NF-κ B 蛋白表达有显著性降低(P<0.05),SIRT6、TSC1和TSC2蛋白的表达显著升高(P<0.05)。结论:1.10周龄Atp4a-/-小鼠可复制GPL小鼠模型;2.GPL模型Atp4a-/-小鼠存在AEG代谢异常,且受活化mTOR/HIF-1 α/SIRT6信号通路的调控;3.胃痞灵可能通过改善GPL小鼠胃黏膜病理学病变、萎缩、肠化及GECs的过度增生、凋亡抑制、去分化等恶性生物学行为,阻止胃黏癌变;4.胃痞灵可通过抑制GPL小鼠胃黏膜mTOR/HIF-1 α/SIRT6信号通路活化所诱导AEG代谢异常,发挥抗GPL、预防胃癌的作用。总之,本研究成功复制10周龄自发性GPL模型Atp4-/-、鼠。WPL可能通过调控mTOR/HIF-1 α/SIRT6信号通路,抑制AEG活性,从而干预GPL小鼠萎缩性病变基础上,肠上皮化生、干细胞去分化GECs的过度增殖,从而发挥抗GPL、预防胃癌。